• 犬瘟热病毒野毒株融合蛋白主要功能区基因的变异研究

    李金中,夏咸柱,殷震,李佑民,涂长春,金宁一

    根据犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白(F)基因的核苷酸序列,设计合成了10条引物。用1对引物从延吉犬病料中扩增出了含F2区基因的314bp的片段,除两端引物序列外为265bp,编码88个氨基酸。它与日本弱毒株(CDV-J)、Onderstepoort弱毒株(CDV-ON)、海豹瘟热病毒2型(PDV2)、1型(PDV1)在核苷酸和氨基酸水平上的同源性,分别为98.1%和95.5%、96.2%和93.2%、94.3%和93.2%、77.4%和87.5%。对5份来自不同地区的CDV病料的融合区基因片段进行了扩增、克隆和序列分析,其中北京1号犬(CDV-B1)、2号犬(CDV-B2)、沈阳犬(CDV-S)和长春犬(CDV-Z)的283bp片段完全相同,而与哈尔滨犬(CDV-H)的该片段有3个核苷酸和2个氨基酸不同。在核苷酸和氨基酸水平,北京犬野毒株等与CDV-H、CDV-J、CDV-ON、PDV2、PDV1的同源性分别为98.9%和97.9%、97.9%和95.8%、96.5%和97.9%、93.3%和98.9%、77.0%和84.2%。本研究揭示了CDV的流行毒株和相关毒株在融合蛋白上的亲缘关系,进一步证实了PDV2?

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  • 新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

    宋长绪,刘福安,杜伟贤

    用SPF鸡胚繁殖新城疫病毒(NDV)F46E9株(强毒)、LaSotaE4株(弱毒),对病毒进行纯化,抽提RNA。用1对均为27个碱基的引物进行RT-PCR,扩增出了2个毒株的融合蛋白裂解位点(Fc)基因。将Fc基因定向克隆入pUC18的EcoRI和SalⅠ位点之间,获得2个毒株Fc基因克隆pUCF46Fc和pUCLaFc,用EcoRI/SalⅠ双酶切法、PstⅠ单酶切法、PCR法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的LaSotaE4Fc基因定向导入表达载体质粒pBV221,获得重组子pBVLaFc。PCR和内切酶酶切法鉴定表明,Fc插入的位置和方向都正确无误。用E.coliDH5α通过热诱导法进行了表达。用SDS-PAGE和Western-blot法检测了表达产物。结果表明,有1条能够与NDV多抗反应的特异条带,分子量约15700,与预期大小一致,说明是Fc基因的表达产物

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  • 新城疫病毒F48E9株病毒糖蛋白的功能分析

    曹殿军,刘明,王莉林,张莹,卢景良

    对抗新城疫病毒(NDV)HN和F糖蛋白的单克隆抗体(McAb)的生物学活性,应用ELISA、HI、HLI、Westernblot等进行了分析,结果证明,NDVF48E9株HN蛋白除有HA和NA功能区外,还有一个促进(启动)融合的功能区。此外,还筛选到4株NDV强毒株特异性McAb,为NDV强弱毒株的鉴别打下了基础

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  • 猪恶性高温综合征(MHS)基因群体检测及部分片段DNA序列研究

    李来记,张沅,李宁

    本研究主要包括:(1)建立了猪MHS基因检测的PCR-RFLP方法。该方法具有准确、快速和无侵害的特点;(2)利用猪MHS基因的PCR-RFLP方法对中国现有猪种20个群体的MHS基因座位的基因和基因型频率进行了检测。结果表明,属于中国的本地品种五指山猪、香猪,引进品种约克夏猪,均不含有MHS基因;在中国本地品种二花脸猪和民猪中,发现存在MHS基因,且民猪的频率较高(0.1562);培育品种北京花猪,引进品种丹系长白猪和杜洛克猪,均有MHS基因;引进品种皮特兰猪、比系长白猪,MHS基因频率最高,分别为0.9520和0.9432;(3)猪RYR1/CRC基因部分DNA序列品种间比较,MHSNN香猪和二花脸猪的1843位为“C”,而MHSnn为“T”;同时还发现一些单碱基的差异

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  • 牛病毒性腹泻病毒P125基因重要区的比较与分析

    王新平,涂长春,李红卫,宣华,朱维正,费恩阁,殷震

    根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NADL株的序列,以计算机辅助设计,化学合成1对引物(W1/W2);应用RT-PCR对国内不同地区分离的4株BVDV的P125基因外源序列插入区进行了扩增,并将扩增的片段进行克隆和序列测定,同时以DNASIS和PROSIS计算机软件将测定的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较分析。结果证实,国内分离的4株BVDV在这一区域中既没有外源序列的插入,也没有基因重组、基因重排或基因缺失,但存在某些核苷酸和氨基酸的替换,表明病毒的致细胞病变作用除与外源序列的插入、基因重组、基因重排或基因缺失有关外,可能还存在其他机制。核苷酸序列的同源性及系统树分析的结果表明,国内的BVDV毒株存在Ia和Ib2个基因亚型,它们均属基因I型BVDV

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  • 狂犬病病毒糖蛋白基因主要功能区的克隆和序列比较分析

    钱爱东,侯世宽,张茂林,李红卫,涂长春,殷震

    对我国不同来源的狂犬病野毒株8202、BRV、MRV以及无毒疫苗株SRV9的G基因405~1144位核苷酸序列进行了RT-PCR扩增、克隆和序列测定,并应用计算机对其进行了分析比较。结果证明,鹿源8202株与中国人用疫苗株为同源株(同源性达97.0%),因此我国鹿狂犬病极可能是人用疫苗毒株污染所致;同地不同动物分离的MRV株和BRV株为亲缘关系较远毒株,表明BRV引起的牛狂犬病不是由于MRV感染所致;疫苗株SRV9与3个野毒株同源性在83%~84%之间。3个野毒株8202、BRV、MRV及疫苗株SRV9的糖基化位点和抗原决定簇内某些氨基酸亦不同。由计算机建立的系统树首次证明我国存在着狂犬病病毒基因亚型。8202、MRV、SRV9和其他对照株的同源性在85.3%以上,为Ⅰa亚型;BRV与它们的同源性仅为82.3%,被分为Ⅰb亚型。从而证明我国存在亲缘关系较远的狂犬病野毒株

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  • HIV-1gag基因重组痘苗病毒的构建和高效表达

    毛春生,金宁一,殷震

    Gag蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(HIV-1)重要的结构蛋白,可诱导机体产生体液和细胞免疫应答。本试验将HIV-1不同长度的长末端重复序列(LTR)和全长的gagORF置于痘病毒启动子控制下,经过同源重组、红细胞吸附试验筛选和间接免疫荧光试验鉴定,分离了6株重组痘苗病毒。免疫印迹(Westernblot)和免疫酶试验检测表明,6株病毒均能表达gag基因,其中以v16LG△2的Gag蛋白表达量最高,占细胞裂解物上清的5.19%,相当于14.7μg/106细胞,接近杆状病毒的表达产量。重组蛋白主要为p55gag蛋白前体,但也有一部分被加工,生成成熟蛋白p24gag、p17gag及其中间蛋白。表达的重组蛋白可形成病毒样粒子(VLP),并可诱导小鼠产生抗Gag蛋白抗体

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  • 人血清白蛋白(HSA)转基因小鼠的制备

    苟德明,郑新民,陈乃清,魏庆信,樊俊华,赵浩斌,龙文,路兴中

    以绵羊金属硫蛋白基因(oMT)为启动子,构建了2种结构的HSA质粒:poMTHSA和poMTHSAUD。其中poMTHSA是将HSAcDNA直接置于oMT启动子的控制下,以pSPORT1为载体构建而成;而poMTHSAUD另融有HSA基因5′,3′侧翼序列(包括内含子1,2,13,14)。将这2种结构的质粒用NotⅠ线化后,注入昆明种小鼠受精卵的雄原核,再移植到假孕受体鼠的输卵管。共注射577枚受精卵,有406枚形态完好的注射卵被移植到19只假孕受体,其中8只妊娠,产仔35只。经PCR及Southern杂交检测,获得了4只转基因小鼠,其中1只来自于注射poMTHSA,3只来自于注射poMTHSAUD。转基因总阳性率和总效率分别为11.4%和0.7%。用RT-PCR技术在转录水平检测4只转基因鼠外源基因的表达情况,结果2只鼠(均来自于注射poMTHSAUD)在肝脏中表达有HSAmRNA,免疫琼脂试验发现,这2只小鼠的血液中均有HSA的表达产物,与RT-PCR检测结果一致。poMTHSAUD在小鼠体内得到了整合和表达;而poMTHSA只有整合而未得到表达,故认为含有侧翼序列及部分内含子的基因poMTHSAUD优?

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  • 生长激素转基因家蝇的建立

    刘维全,殷震,龚和,齐顺章,朱宝利,涂长春,苟鸿鹰,王嫣,许丽艳,孙明

    利用显微注射技术,将人生长激素表达载体导入家蝇受精卵,人工孵化后收集子1、2代卵,提取染色体,经核酸探针及PCR特异片段扩增检测,两代均为阳性。对整合阳性卵孵化至幼虫,热冲击诱导后立即进行表达检测,结果发现,人生长激素在蝇幼虫体内实现了表达,表达量最高可达4.04μg/L。对转基因家蝇不同发育阶段的表型特征进行了观察,未发现明显变化

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  • 基因探针和PCR对鲤吉陶单极虫的检测

    陶增思,黎诚耀,卢强,王振英,张西臣,汪建国,李德昌

    采用液氮冷冻研磨法破碎吉陶单极虫(Thelohaneluskitauei)孢子,按常规法提取其基因组DNA。取DNAEcoRI消化产物,采用低熔点琼脂糖回收法制备大(3.0~15.0kb)、小(0.5~3.0kb)片段,将其克隆于pBluescriptksEcoRI位点,经α-互补现象、酶切鉴定和虫体DNA生物素标记探针筛选,构建了含23个克隆的基因文库,克隆片段介于0.9~6.8kb之间;经阳性克隆标记筛选及特性分析,制备了长度为0.9kb(19号质粒克隆片段)的探针,该探针具有较强的敏感性和特异性。对该探针两端DNA序列进行分析,设计出1对引物。上游引物序列为:5′TTTCGAACCCGCACAACAAG3′,下游引物序列为:5′TGAGTGGATAG-TATCGCTGC3′。应用该对引物对虫体进行了检测

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  • 镉对小鼠肝线粒体膜流动性及呼吸活性的影响

    马卓,陈万芳

    采用1,6-二苯基-1,3,5-己三乙烯(DPH)荧光偏振法研究了镉在小鼠体内对肝线粒体膜流动性的影响,同时观察了膜结合酶活性和线粒体呼吸功能的变化。结果表明,镉能显著增加小鼠肝线粒体膜的荧光偏振度(P)及微粘度(η),并导致线粒体呼吸控制比(RCR)和氧化磷酸化效率(ADP/O)显著下降。膜结合K+、Na+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性均受到明显抑制。实验结果提示硒能有效地保护镉所诱导的这些损伤变化

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  • 标准差(s)与标准误(sx)的正确使用

    邹尔新

    标准差(s)与标准误(sx)的正确使用样本标准差(s)是描述正态或近似正态分布数据变异程度的统计量,s的大或小说明数据取值的分散或集中。s与样本均数(x)合用,主要是在大样本调查研究中,对正态或近似正态分布的总体正常值范围进行估计。常用x±1.96s...

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  • 关节炎大鼠背根节中α-CGRP和β-CGRPmRNA变化及针刺效应

    李文武,朱丽霞,文琛,张金铃,赵飞跃

    用原位核酸分子杂交技术观察了佐剂性关节炎大鼠背根节(DRG)中α-与β-降钙素基因相关肽(α-CGRP和β-CGRP)mRNA的表达及电针的效应。结果表明,在正常动物DRG中有38.25%神经元标记α-CGRPmRNA,32.8%标记β-CGRPmRNA,且α-CGRP和β-CGRPmRNA主要在小细胞(分别为18.16%和19.56%)和中细胞(11.32%和11.67%)中表达,在少数大细胞(8.63%)中主要表达α-CGRPmRNA;动物在注射佐剂后第2天,DRG中标记α-CGRP和β-CGRP的细胞数增多,银粒密度增加;在佐剂后第14天动物形成多发性关节炎时则进一步增多,主要是被标记的小细胞数增多,分别为28.48%和30.29%,标记细胞的银粒密度也进一步增加,但在大细胞和中细胞中未见明显的变化;关节炎动物经电针治疗后,DRG中被标记的α-CGRP和β-CGRPmRNA小细胞数的增加有所减少,分别为23.85%和25.73%,标记细胞中银粒的密度也比关节炎组有所减少。以上结果说明,关节炎大鼠一级传入神经元中α-CGRP和β-CGRP的合成增加,而电针治疗使CGRP合成增加的反应减弱。CGRP合成增?

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  • 催乳素对促性腺激素诱导的鸡卵泡膜细胞类固醇激素合成的抑制作用

    李莹辉,汪琳仙,杨传任

    利用无血清培养的鸡卵泡(F3)膜细胞模型研究了催乳素(PRL)对卵泡膜细胞类固醇激素合成的作用。用不同剂量的PRL、黄体生成素(LH)及促卵泡激素(FSH)分别或共同处理在无血清培养液中培养了48h的鸡卵泡膜细胞,24h后收集培养液,测定培养液中睾酮(T)和雌二醇(E2)含量。结果表明,LH能明显刺激膜细胞合成T和E2,并具有剂量依赖关系;PRL单独对膜细胞类固醇合成无明显作用,但可抑制LH诱导的T和E2合成,以及FSH刺激的E2合成。本研究证明PRL能作用于鸡卵泡膜细胞,并能抑制促性腺激素LH和FSH诱导的类固醇激素的合成

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  • 牦牛卵泡液LDH同工酶及外源性激素对其表达模式的影响

    刘宗平,余四九,陈北亨

    采用比色法和不连续缓冲系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对未孕和怀孕初期牦牛卵泡液乳酸脱氢酶(LDH)活性及同工酶进行了测定,并分析了促卵泡素3号(LRH-A3)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)和孕马血清促性腺激素(PMSG)对其表达模式的影响。结果表明,未孕和怀孕初期牦牛卵泡液LDH活性分别为200.4±31.1,215.3±86.6μmol·s-1·L-1,同工酶有5条谱带。3种外源性激素均使牦牛卵泡液LDH活性显著升高(P<0.01),LDH同工酶带型分布发生变化,降低了LDH2/LDH1比值,改变了同工酶中A和B亚基所占比例

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  • 恩诺沙星在猪体内的生物利用度及药物动力学研究

    曾振灵,冯淇辉

    选用21头健康杂种猪,随机分为3组,对静注、肌注及内服恩诺沙星(2.5mg/kg)的生物利用度和药物动力学进行了研究。用乙腈提取血浆中的药物,反相高效液相色谱法测定血浆中恩诺沙星及其主要代谢产物环丙沙星的浓度。所得血药浓药-时间数据用MCPKP计算机程序处理。静注给药的药时数据适合二室开放模型,主要药物动力学参数:t1/2α0.48±0.24h;t1/2β3.45±0.85h;t1/2K102.01±0.39h;V11.22±0.21L/kg;Vd(area)3.34±0.69L/kg;Vd(ss)1.85±0.33L/kg;ClB0.423±0.044L·kg-1·h-1;AUC5.967±0.655mg·L-1·h-1。肌注给药的药时数据适合一级吸收一室模型,主要药物动力学参数:t1/2ka0.26±0.09h;t1/2ke4.06±0.48h;tmax1.12±0.27h;Cmax0.79±0.17mg/L;AUC5.483±1.098mg·L-1·h-1;F91.9%±18.4%。内服给药的药时数据适合一级吸收二室模型,主要药物动力学参数:t1/2ka0.23±0.08h;t1/2α1.53±0.7?

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  • 猪核移植重组胚胎的发育能力

    陈乃清,赵浩斌,苟德明,樊俊华,魏庆信,渊锡藩

    以McGrath-Solter(1983)提供的去(注)核方法,将猪胚胎的单个卵裂球细胞注入去核的次级成熟卵母细胞,借助电融合的方法(AC:5V,1.5MHz,10~15s;DC:2kV/cm,40μs。电激活/融合液:0.3mol/L甘露醇+0.1mmol/LMgSO4+0.1mmol/LCaCl2+7.5mg/mLCCB)融入受体胞质构成重组胚,体外培养(培养液为改良TCM-199;培养条件为5%CO2,95%空气,38.5℃,饱和湿度)使之发育。实验结果表明:(1)分离单个卵裂球时,以0.25%链霉蛋白酶E消化透明带效果最佳。单个卵裂球获得率可达91.7%(88/96);(2)核受体以激活后2h的卵母细胞优于未激活的卵母细胞,卵裂率分别为64.6%(31/48)和34.5%(19/55)(P<0.05);(3)体外成熟卵母细胞与体内成熟卵母细胞在作为核受体时,其重组胚的发育能力无显著差异(分别为58.7%,65.6%,P>0.05);(4)作为核供体的胚胎对于重组胚的发育能力有显著影响。MZT(maternalzygotetransfer,母子转变,是指早期胚胎发育由母源控制向合子控制的转折点)以后的?

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  • BFF、rbGH对牛卵泡卵母细胞体外受精后发育的影响

    徐照学,钱菊汾,兰亚莉,张趁心,辛晓玲,贺文杰

    利用屠宰黄牛卵巢,对2~5mm卵泡卵母细胞的体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)、受精卵的体外培养(IVC)进行了系列研究。结果表明,在成熟培养液中单独添加10%D0ECS(发情当天牛血清)获得了卵泡卵母细胞受精后较高的卵裂率(64.7%)、桑椹胚发育率(39.9%)和囊胚发育率(24.8%),说明在成熟培养液中单独添加D0ECS是可行的;在含10%D0ECS的成熟培养液中再添加10%或20%BFF(牛卵泡液),均能提高受精卵的卵裂率以及桑椹胚和囊胚的发育率,以添加20%BFF效果较好,其囊胚发育率(35.0%)显著高于对照组(24.8%,P<0.05);在卵泡卵母细胞成熟培养系统和受精卵共同培养系统中添加10μg/L重组牛生长因子(rbGH),虽对体外受精卵的卵裂率无显著影响(P>0.05),但能显著提高卵裂胚的囊胚发育率(P<0.05)

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  • 血浆极低密度脂蛋白浓度的双向选择对肉鸡腹脂、肝脂和产肉性能的影响

    陈金文,杨山,赵河山,文伯珍,莫棣华,雷春,胡刚安,王世成

    对零世代8周龄血浆极低密度脂蛋白(VLDL)浓度进行降低腹脂的间接选择,一世代取得了明显效果:腹脂和肝脂向两极分化,其中肌胃脂和肝脂选择反应较大。低血浆VLDL的选择使腹脂降低,肝脂增加,对产肉性状未产生不利影响。9周龄腹脂率、板油率和肌胃脂率在高VLDL系分别高于低VLDL系21%,16%和51%;肌胃脂率品系间差异极显著(P<0.001)。品系与性别互作对肌胃脂率有明显影响(P<0.05)。腹脂、肌胃脂存在性别差异,腹脂率雌性略高于雄性,而肌胃脂率雄性高于雌性。9周龄肝脂率,高VLDL系显著低于低VLDL系(P<0.01),雌性高于雄性。一世代8周龄血浆VLDL产生了直接选择反应,血浆VLDL浓度,高VLDL系高于低VLDL系。血浆VLDL存在性别差异,雄性高于雌性。一世代高、低VLDL系血浆VLDL和腹脂的变异系数仍然很大,继续对其选择仍然有效。由于血浆VLDL属中等遗传力,并且家系间差异显著,因此,在世代选育中应采取家系结合个体选择法

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