猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株GF1107株ORF7基因的克隆与表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR2332株的核衣壳蛋白基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物。应用RT-PCR方法扩增PRRSV GF1107株(GenBank登陆号:AY684124)的ORF7片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中获得含有相应片段的重组质粒pMDHB-ORF7。对质粒中的插入片段进行测序,应用DNAstar序列分析软件对所测序列与GenBank中PRRSV毒株进行同源性比较。将ORF7基因克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,在IPTG的诱导下成功获得表达,经Western blotting分析表明,表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,为PRRSV新型诊断试剂的研究奠定了基础。

水泡性口炎病毒G蛋白抗原决定区片段基因在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR的方法扩增水泡性口炎病毒G蛋白抗原决定基部分基因片段,构建克隆质粒pMD18-T-G660和表达质粒pET-28a-G660,转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,得到高效表达,表达蛋白质的相对分子质量为30 000,占总蛋白的20.745%。

IBV3株分离株的血清中和试验及S1基因同源性分析

通过血清中和试验、RT-PCR、核酸序列分析和S1基因的同源性分析,表明鸡传染性支气管炎病毒(IBV)BJ9601、HN9604与M41株的血清中和效价最高,其次为H120,TJ9602与试验毒株的血清中和效价较低。BJ9601、HN9604的S1基因与H120和H52的同源性很高,与H120和H52同在一个分支,其来源与H120或H52有密切关系。TJ9602的S1基因只与LDT3的同源性达到93%,共同形成一个分支,与其他毒株的同源性均在88%以下。血清中和试验和S1基因同源性之间存在较高的相关性,但并不能达到完全的吻合,即血清中和效价最高的毒株之间S1基因的同源性并不是最高的。在GenBank中登记的IBV中国大陆分离株的S1基因可分为3个基因群,其中Ⅰ群和Ⅱ群是主要的流行毒株,共有38个分离毒株,占90.48%。

免疫层析试纸条(ICS)检测禽流感抗体

以纯化的禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)核蛋白作为捕捉抗原,金标兔抗鸡抗体作为金标二抗,建立检测禽流感血清抗体的胶体金免疫层析试纸条(immunochromatographic strip,ICS)。对标准阳性血清不同滴度进行检测,ICS试验的敏感性高于琼脂扩散试验(AGP)。特异性试验证实,禽流感的ICS试验与新城疫(ND)、传染性支气管炎(IBV)、鸡传染性法氏囊病(IBD)及减蛋综合症(EDS-76)均无交叉反应。同时,用ICS试验和HI试验检测105份鸡血清,两者具有较好的符合性。结果认为:禽流感ICS具有快速简便、特异、灵敏等优点。

不同时期NDV地方株F基因的克隆及序列分析与基因型研究

利用RT-PCR技术对1998-2002年间洛阳地区新城疫典型发病禽群中所分离到的15个毒株的F基因主要功能区片段进行了克隆和序列分析,并根据其47~435位核苷酸序列构建了系统进化树,确定了其毒力强弱和基因型。结果显示,依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同,15个地方毒株可分为3群,群内各毒株同源性较高,群间差异较大,未发现有因分离禽品种不同所引起的明显的株间差异。其中第1群9株,涉及到各时间段分离的毒株和所有分离禽品种,属典型的基因Ⅶ型强毒株,高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚型区;第2群4株,属传统的基因Ⅵ型强毒株,分散于进化树的基因Ⅵ型区;第3群2株,属古典基因Ⅱ型的弱毒株,分散于进化树的基因Ⅱ型区。结果表明,近年来该地区流行的新城疫病毒以新的基因Ⅶ型为主,同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型;并提示基因Ⅶ型各毒株在该地区流行的时间较短,株间差异不大。

胸膜肺炎放线杆菌4型菌毛亚单位基因apfA特异性片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR扩增其apfA特异性基因片段,PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达质粒pGEX-apfA,转化到感受态大肠杆菌DE3中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳。结果表明,25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98%,所表达的融合蛋白相对分子质量约为42 000,与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。

堆型艾美球虫3-1E基因在大肠杆菌中的可溶性表达及鉴定

将堆型艾美球虫(E.acervulina)3-1E基因克隆至pET-32a(+)载体中,转化大肠杆菌BL21,在37℃下,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为38 500的重组蛋白。Western blot检测证实,该重组蛋白可以与特异性抗血清结合。在20℃条件下,以终浓度分别为2.0、1.0、0.5 mmol/L的IPTG进行诱导,当IPTG终浓度为0.5 mmol/L时,以可溶性形式存在的目的蛋白含量最高。

猪链球菌2型四川分离株猪体回归试验

选用35~38日龄的健康断奶仔猪21头,分3组,用2005四川分离株SSsc0501分别经静脉、肌肉注射和口服3种途径感染,进行猪体回归试验。肌肉注射组(含菌0.6×108个/mL)16 h开始出现症状,至36 h全部死亡,发病率、病死率均为100%;静脉注射组(含菌0.2×108个/mL)25 h开始出现症状,48 h内全部死亡,发病率和病死率均为100%;口服攻毒组(含菌2×108个/mL)90 h后开始有发病症状,第9天有1头死亡,发病率75%,病死率33%。从感染病死猪的肝脏、脾脏、肾脏、心血、大脑、脑脊液、淋巴结、肺脏和关节液中均分离到链球菌,经鉴定为试验攻毒的目的菌,表明猪体能够很好地用于猪链球菌2型动物感染模型,同时说明该菌侵害器官广泛,为进一步探讨该病的综合防制提供了重要技术依据。

猪生长激素抗独特型抗体的制备及免疫学鉴定

应用猪生长激素(Ag)纯品,通过杂交瘤技术制备了猪生长激素单克隆抗体(Ab1)。Ab1经免疫亲和层析柱纯化后免疫新西兰白兔,其血清经饱和硫酸铵纯化后获得猪生长激素抗独特型抗体(Ab2)。再应用ELISA等方法进行鉴别。Ab2与Ab1呈阳性反应,与BALB/c小鼠r球蛋白呈阴性反应;Ab2与Ag竞争结合Ab1;Ab2抑制Ab1与Ag的结合。Ab1是针对猪生长激素纯品的单克隆抗体。Ab2是具有猪生长激素抗原内影像的抗独特型抗体。

鸡白细胞介素-6活性MTT检测方法的建立

采用白细胞介素-6依赖细胞株B9建立了鸡白细胞介素-6活性的MTT检测方法。每孔培养细胞数在2.5×103~4×104范围内D值与细胞数显示有良好的线性关系,MTT的最佳保留时间为4 h,最低检测限为0.1 U/mL。应用该方法检测了健康艾维茵肉鸡25例,血清chIL-6活性为(4.33±0.75)U/mL,而25例葡萄球菌病患鸡血清chIL-6的活性为(14.05±6.87)U/mL,与健康肉鸡比较差异极显著(P<0.01),为该方法进一步临床应用奠定了基础。

一氧化氮介导内毒素所致的外周血淋巴细胞凋亡及阳离子A的保护作用

采用内毒素(ET)所致家兔ET休克模型,分别在相应处理后3、4、8、12 h检测血浆中NO含量的动态变化;用荧光显微镜观察外周血淋巴细胞(PBL)的凋亡情况并计算凋亡指数;用琼脂糖凝胶电泳检测PBL凋亡的特征性DNA降解,并观察阳离子A(CA)注射液对上述指标的影响。结果显示,模型组中各时间段的血浆中NO含量均显著高于对照组(P<0.01),随着NO含量的增加,PBL凋亡指数明显上升(P<0.01),其基因组DNA在处理后3、4、8 h均发生180~200 bp及其整数倍的“阶梯状”断裂,12 h出现“弥散状”条带;CA保护组中NO水平和PBL凋亡指数均出现不同程度的降低(P<0.01,P<0.05),并且在电泳结果中无明显的“梯状”条带。提示ET可使血液中NO含量升高,NO参与了ET休克的发病机制,介导PBL凋亡,在晚期介导PBL坏死;而CA可有效地中和血液循环中的ET,明显降低机体内NO的含量,抑制PBL凋亡和坏死,对ET休克有一定的保护作用。

应用半定量RT-PCR方法测定围产期奶牛肝PEPCK-C mRNA的丰度

建立了奶牛肝PEPCK-C mRNA丰度的半定量RT-PCR检测方法,其优化的PCR反应条件(25μL)为:57℃退火、2.4 mmol/L Mg2+、26~28个循环数、cDNA不小于2.6 mg/L、2∶1的PEPCK-C/β-actin引物比。同时,应用该方法检测了围产期奶牛肝中PEPCK-C mRNA丰度,结果显示:产前低血糖奶牛肝PEPCK-C mRNA丰度显著低于对照组,但是产后却高于对照组。围产期奶牛血糖水平与肝PEPCK-C mRNA丰度之间的相关系数,对照组为0.68(P=0.14),低血糖组为0.82(P=0.047)。因此,围产期奶牛肝PEPCK-C mRNA丰度对奶牛血糖浓度具有调节作用,低血糖奶牛表现得更为明显。

桔梗的“引经”作用对左旋氧氟沙星在鸡体内药物分布的影响

72只25日龄健康黄杂鸡随机均分为2组,Ⅰ组单剂量内服左氧氟沙星(10 mg/kg),Ⅱ组左氧氟沙星(10 mg/kg)与桔梗煎液(2 g/kg)联合内服。采用高效液相色谱法测定鸡体内不同组织中药物的浓度。结果表明,桔梗与左氧氟沙星联用,明显影响了左氧氟沙星在健康鸡体内的分布,其中,肺、心、肾组织最高药物浓度较单用左氧氟沙星组显著增高,而肝脏的药物浓度较单用左氧氟沙星有所降低。

静脉注射L-氨基胍对肉鸡肺动脉压及其相关指标的影响

按常规饲养条件饲养AA雄性肉鸡120羽,30日龄时随机分为试验组(T组)和对照组(C组)。T组肉鸡静脉注射L-AG(40 mg/kg),C组肉鸡静脉注射生理盐水。分别在注射L-AG和生理盐水1、2、4 h后测定平均肺动脉压(mPAP)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性、原生型一氧化氮合酶(cNOS)活性、一氧化氮(NO)含量、红细胞压积(PCV)、电解质浓度、pH、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。结果显示:(1)试验组mPAP、NO含量和iNOS活性均显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01);(2)PCV和Ca2+在给药后2h和4 h与对照组差异显著(P<0.05);(3)K+浓度在给药1 h和2 h后显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)。结果表明,L-AG通过抑制iNOS活性,引起肉鸡肺动脉压的升高,从而推测iNOS具有调节肉鸡体内mPAP的作用并与肉鸡肺动脉高压综合征发生有着密切的联系。

心钠素在肉鸡腹水综合征发生发展中的作用

大群艾维茵商品代肉鸡从1日龄起用高能日粮常规饲养,以获得自然腹水综合征(ascites syndrome,AS)病例。应用放射免疫分析方法,分别测定了2~6周龄正常组、轻度腹水组、重度腹水组肉鸡血浆和5周龄时心、肝、肺、肾等组织心钠素(atrial natriuretic polypeptide,ANP)的含量;用右心导管法测定了平均肺动脉压(mPAP),并用常规方法测定了腹水心脏指数(AHI),同时还对血浆ANP的含量与AHI、mPAP的相关性进行了分析。结果发现,随着日龄的增长,ANP的含量增加,AHI、mPAP也随着发生明显的变化;随腹水程度的加深,mPAP、AHI以及肉鸡血浆、组织ANP的含量均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高,组织中ANP的含量明显比血浆中的高;另外还发现,不同腹水程度肉鸡血浆ANP含量与5~6周龄时的mPAP、4~5周龄时的AHI相关性显著(P<0.05)。结果表明,ANP参与了肉鸡AS的发生和发展过程并与肉鸡发生AS的程度有密切关系。

出生前山羊大脑皮质的形成和发育

对山羊胚胎大脑皮质形成及其神经元发育的形态学变化进行了研究,结果表明:(1)山羊胚胎不同类型大脑皮质的皮质板形成时间顺序为旧皮质、新皮质→海马皮质,与种系发生规律相反,提示神经系统内部结构的形成并非完全符合种系进化,而与动物个体组织结构自身的发展相关。不同类型大脑皮质皮质板的分化顺序为古皮质→旧皮质→新皮质,与种系发生的顺序相符。(2)山羊胚胎海马皮质锥体细胞的发育较早,按由深到浅的次序发育,而海马皮质中的非锥体细胞于第19周开始发育。梨状叶皮质锥体细胞发育的较早,最先出现在深层,颗粒层第18周出现。大脑新皮质各层神经元发育顺序依次为:内锥体层→外锥体层、多形层→内颗粒层→外颗粒层。各种类型皮质的神经元在出生前都未发育成熟。

谷氨酰胺对肉仔鸡免疫器官发育及免疫功能的影响

240只1日龄艾维茵肉仔鸡,随机分为4组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ~Ⅳ组为试验组,各组分别在基础日粮中添加0、0.1%、0.2%及0.4%的谷氨酰胺(Gln),研究Gln对肉鸡免疫器官发育及免疫功能的影响。结果表明:饲料中添加不同剂量的Gln均可显著提高14日龄肉鸡的胸腺和脾脏指数(P<0.05),且有明显量效关系;21、28日龄时上述指标仍高于对照组,但仅Ⅱ、Ⅲ组与对照组差异显著;Gln对法氏囊的发育无明显效果;添加Gln可显著提高肉仔鸡外周血淋巴细胞的转化率及T淋巴细胞数量,增强肉仔鸡对新城疫疫苗的免疫应答(P<0.05),对提高肉仔鸡血清IgG水平亦有一定作用,其中14日龄时以添加0.4%的Gln作用效果最好,而28日龄时则以添加0.1%的Gln效果最好,Gln对红细胞免疫功能没有明显作用。

猪卵母细胞去核方法的改进

对猪体细胞克隆技术中关键步骤之一的去核方法作了较深入的研究。结果表明,由本实验室改进的Willadsen去核法———二步挤压去核法,无论在去核操作成功率(73.9%)上还是在去核效率(81.2%)上都明显好于McGrath-Solter去核法(42.5%、67.4%,P<0.05);同时,本试验还发现,卵母细胞成熟培养36 h后去核组去核效率(89.1%)显著地高于成熟培养44 h后去核组(55.8%,P<0.05),而核移植重构胚的发育率2个组间无显著差异。

A型流感病毒跨动物种感染机制的研究进展