- 陆慧君;贺文琦;高丰;常灵竹;赵魁;盖显英;王龙涛;宋德光;
应用特异性引物从猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)中扩增出S1蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体中,得到重组质粒pTS1。用EcoRI和Not I双酶切pTS1,回收目的基因S1片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAS1。用BstXI酶切pPICZαAS1使其线性化,并电转至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果显示,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为73000的重组蛋白,且该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明HEV的S1蛋白片段在毕赤酵母中获得成功表达。
2008年01期 No.133 1-4页 [查看摘要][在线阅读][下载 183K] [下载次数：163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 李玉峰;姜平;蔡宝祥;简中友;
从江苏某种猪场自北美引进的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体阳性临床健康仔猪血清中分离到1株病毒,经生物学特性测定、血清学试验、分子生物学鉴定、电镜观察及猪体致病性试验,鉴定为美洲型PRRSV类弱毒株。应用RT-PCR技术对该分离株ORFs3～7结构蛋白基因进行扩增、克隆与cDNA序列分析,结果表明该分离毒株的ORFs3～7基因序列与PRRSV-MLV弱毒株的相应基因同源性均达99.0%以上,属美洲型毒株。
2008年01期 No.133 5-8页 [查看摘要][在线阅读][下载 84K] [下载次数：427 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 韩贞珍;金宁一;沈国顺;庄天中;孙中锋;李臻;付延军;李太元;李红文;郑敏;
构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白和金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)共表达的核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。将采自长春患PRRS病猪的组织剪碎充分研磨,提取病毒RNA后,用RT-PCR的方法特异性扩增PRRSV长春株的ORF6基因(M蛋白)片段。将该片段定向插入到载体pKS-SEA上,双酶切获得片段SEA-ORF6,再将其克隆到真核表达载体pVAXI中,构建重组质粒pVAXI-SEA-ORF6,转化大肠杆菌。经酶切鉴定后,将构建的阳性重组质粒在BHK细胞中表达。通过间接免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性,用Western blot分析表达蛋白的特异性。结果表明,所构建的重组质粒pVAXI-SEA-ORF6在BHK细胞中得到了表达,为进一步研究PRRSV基因工程疫苗奠定了基础。
2008年01期 No.133 9-11页 [查看摘要][在线阅读][下载 183K] [下载次数：219 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 谷长勤;罗玲;胡薛英;张万坡;周诗其;程国富;
应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化的dUTP切口末端标记(即TUNEL)法和透射电镜(TEM),对人工感染H9N2亚型禽流感病毒蛋鸡的脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体进行了细胞凋亡动态研究。结果显示,感染蛋鸡脾脏、胸腺、法氏囊中细胞凋亡率升高。接种后3d,脾脏和法氏囊的细胞凋亡率升至最高值分别为6.2%和1.7%,随后下降,但在接种后14d仍显著高于对照组(P<0.05)。胸腺的细胞凋亡率从接种后3～21d均极显著地高于对照组(P<0.01)。而盲肠扁桃体的细胞凋亡率在整个试验期间变化不明显。电镜下凋亡细胞呈典型的形态学特征:细胞染色质固缩并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或环状小体。结果表明,H9N2亚型禽流感病毒感染蛋鸡能诱导免疫器官的细胞凋亡。
2008年01期 No.133 12-14页 [查看摘要][在线阅读][下载 151K] [下载次数：254 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：22 ] |[阅读次数：0 ] - 王金勇;齐静;方杰;颜焰;申会刚;周继勇;
依据鸡白细胞介素2(chIL-2)全基因组序列设计引物探针,以简易基因组抽提法获得的鸭外周血单核细胞基因组DNA为模板,用长距离聚合酶链式反应(LD-PCR)扩增出鸭白细胞介素2(duIL-2)全基因片段。经序列测定,得到的duIL-2基因组DNA序列全长为3528bp。运用生物信息学方法对duIL-2的基因、启动子结构和cDNA序列编码的成熟蛋白进行系统分析,结果表明,duIL-2基因具有典型的4个外显子和3个内含子结构,和已知禽类及哺乳类同系物基因总体结构具有明显的相似性。鸭和鸡及其他哺乳动物IL-2基因的启动子序列具有显著的保守性,都具有AP-1、NF-AT、CD28RE、OCT、TATAbox转录起始因子结合位点和预测的转录起始位点。duIL-2cDNA序列编码的成熟蛋白进化分析表明,鸭和鹅的亲缘关系最近,和哺乳动物的亲缘关系较远,显示出明显的种属差异。
2008年01期 No.133 15-19页 [查看摘要][在线阅读][下载 203K] [下载次数：177 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 周祖涛;陈芬芬;李自力;胡思顺;孙淑娜;吴仁蔚;肖运才;许青荣;毕丁仁;
利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株(RA-YM),根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与其他不同RA菌株OmpA基因之间的核苷酸序列同源性为93%～97%。用pGEX-KG构建了原核表达载体pKG-OmpA,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白大小约为68000,Western-blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。
2008年01期 No.133 20-23页 [查看摘要][在线阅读][下载 166K] [下载次数：433 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：0 ] - 宋战昀;冯新;韩文瑜;刘伟;刘影波;丁壮;
通过糖链检测试剂盒对Vero细胞进行细胞凝集素组织化学染色鉴定,结果显示,Vero细胞与凝集素MAA和SNA呈强阳性反应,而与凝集素GNA和PNA呈阴性反应,表明Vero细胞表面具有唾液酸α2-3连接的半乳糖和唾液酸α2-6连接的半乳糖。Vero细胞神经节苷脂提取及纯化结果显示,GD1a是主要神经节苷脂组分,同时还存在GM1、GM2和GM3。为进一步确定神经节苷脂在病毒入侵中的作用和意义,使用神经节苷脂标准品及Vero细胞神经节苷脂提取物对新城疫病毒和鹅副粘病毒分别进行红细胞吸附抑制试验,结果表明,2种病毒与不同类型神经节苷脂结合特异性上存在差异。
2008年01期 No.133 24-27页 [查看摘要][在线阅读][下载 448K] [下载次数：232 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 秦海斌;刘怀然;曲连东;刘家森;韩凌霞;姜骞;李亚明;杨增岐;
用兔出血症病毒(RHDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立RHDV抗原捕获ELISA检测方法,优化反应条件并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为1mg/L,兔多抗血清最佳质量浓度为4mg/L。本方法可特异性地检测出兔肝脏病料中的RHDV,纯化病毒的最低检出量为26μg/L。对已知阳性样品的检测显示,捕获ELISA检测的病毒滴度是HA试验的3～13倍。对67份可疑病料,捕获ELISA阳性检出率为62.7%,HA试验阳性检出率为55.2%。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。本方法敏感性、特异性、稳定性良好,可应用于RHDV的快速、批量、特异检测。
2008年01期 No.133 28-31+44页 [查看摘要][在线阅读][下载 159K] [下载次数：227 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：0 ] - 刘红芹;朱瑞良;胡晓娜;王伟;李新苍;毕建敏;刘红珍;
采用PCR方法对本实验室分离保存的10株禽波氏杆菌、3株兔支气管败血波氏杆菌及1株猪支气管败血波氏杆菌菌株,扩增其16SrRNA基因的5′端片段(783bp),并测定所得片段的DNA序列。用DNAStar分析软件将所获得的序列与GenBank中的禽波氏杆菌序列进行比较,由此构建禽波氏杆菌菌株的系统发育树。结果显示,10株禽波氏杆菌核苷酸序列与GenBank中收录的AF177666株禽波氏杆菌核苷酸序列的同源性为82.0%～82.5%,与兔支气管败血波氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌核苷酸序列的同源性均为99.2%～99.9%,其中P9(山鸡波氏杆菌)、P11(兔支气管败血波氏杆菌)与P14(猪支气管败血波氏杆菌)分别发生1个核苷酸的缺失。本试验结果表明,16SrRNA序列分析是鉴定禽波氏杆菌的一种快速而准确的方法。
2008年01期 No.133 32-34页 [查看摘要][在线阅读][下载 110K] [下载次数：243 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：0 ] - 周霞;程安春;汪铭书;剡根强;马勋;韩素娟;
从新疆部分地区羊场近年来发生的以脑炎为主要临床特征的病死羔羊体内分离出2株细菌,经鉴定为粪肠球菌。经链球菌A-G乳胶分型诊断液检测后确定为D群链球菌。该菌对小鼠和羔羊有较强的致病性,人工感染可引起小鼠的死亡,感染羔羊能够复制出与自然感染相同的临床症状和病理变化,并从感染发病和死亡羊的脑、心血、肝脏中再分离到相同细菌,分离菌对万古霉素、氟苯尼考、头孢噻肟钠、诺氟沙星和恩诺沙星敏感,根据GenBank中粪肠球菌主要毒力因子的基因序列设计引物进行PCR检测,结果显示,1株细菌明胶酶(GelE)、聚合物质(Asa1)、心内膜炎抗原(efaA)、胶原蛋白黏附素(Ace)、新的表面蛋白1(EF3314)等毒力因子基因阳性;另1株细菌溶血素激活因子(CylA)、表面蛋白(esp)、聚合物质(Asa1)、心内膜炎抗原(efaA)、胶原蛋白黏附素(Ace)、2种新的表面蛋白1和2(EF0591和EF3314)等毒力因子基因为阳性。
2008年01期 No.133 35-39页 [查看摘要][在线阅读][下载 138K] [下载次数：450 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：35 ] |[阅读次数：0 ] - 丁壮;Shinji TAKAI;Hiroo MADARAME;常爽;黄海楠;霍晓伟;高明华;谭忠田;高双成;Fumiko HATORI;Yukako SASAKI;Tsutomu KAKUDA;Shiro TSUBAKI;
对中国内蒙古自治区饲育马土壤环境中马红球菌的分布知之甚少;为此,在中国内蒙古通辽近郊、内蒙古南部锡林郭勒盟大草原、内蒙古东部呼伦贝尔大草原等马场共收集了108份土壤样品进行了马红球菌的检测。结果,锡林郭勒盟大草原和呼伦贝尔大草原的马红球菌分离率为25.9%～30.0%,通辽近郊土壤中分离率高达82.3%。这说明在通辽近郊马红球菌的分离菌数是草原土壤中马红球菌分离菌数的10倍。应用PCR技术检测了488株的毒力相关基因,相对分子质量分别为15000～17000(VapA)和20000(VapB)。所有的分离株都未检出毒力相关基因。这些无毒力分离株的质粒资料显示,各种大小的潜在质粒的发生率为13.3%～21.5%。本研究结果截然不同于我们新近对蒙古国的调查结论:马红球菌在蒙古国乌兰巴托的马群中不存在。造成这一差异的原因可能在于蒙古国的游牧生活和内蒙古的非游牧生活。
2008年01期 No.133 40-44页 [查看摘要][在线阅读][下载 75K] [下载次数：88 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 路浩;黄有德;刘宗平;
采用病毒、真菌、细菌学及血清学等检验方法,对甘肃兴隆山马麝以出血性肺炎或纤维素性-化脓坏死性肺炎为主要特征的呼吸系统疾病的病原进行了系统研究。结果表明,马麝的呼吸系统疾病是由巴氏杆菌(P.multocida)单独感染或与大肠杆菌(E.coli)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)混合感染的一种普通传染性疾病。药敏试验表明,这3种细菌均对苄星青霉素、硫酸链霉素、复方磺胺甲噁唑片、酒石酸泰乐菌素敏感,而对麦迪霉素不敏感。
2008年01期 No.133 45-47页 [查看摘要][在线阅读][下载 28K] [下载次数：151 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：0 ] - 王承民;秦建华;郑素玲;何宏轩;杭柏林;魏刚才;陈桂香;
为了用针对堆型艾美耳球虫子孢子的5株单抗检测各代裂殖子的反应性,分别用甲醇、丙酮、戌二醛和自然干燥等4种固定方法处理裂殖子,观察其对染色结果的影响;并运用免疫荧光技术(IFA),对单抗和裂殖子进行染色。结果显示,5株单抗中,单抗Easp-3H6和单抗Easp-5G10识别堆型艾美耳球虫裂殖子的抗原位于裂殖子的顶端,单抗5B4对各阶段裂殖子有较弱的反应,而单抗Easp-3G3和5G7不与堆型艾美耳球虫任何一代的裂殖子发生反应,表明鸡堆型艾美耳球虫的侵入阶段存在共有抗原,即种内各发育阶段的抗原。
2008年01期 No.133 48-50页 [查看摘要][在线阅读][下载 33K] [下载次数：84 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 宁章勇;赵德明;杨建民;周向梅;于博;孔小明;尹晓敏;
采用实时荧光定量RT-PCR的方法,对PrP106-126处理的大脑皮质神经元和星形胶质细胞模型进行了朊蛋白基因表达相对定量的研究。大脑皮质神经元经PrP106-126处理后,与SCR处理组和对照组相比,基因表达量明显下降。PrP106-126处理的星形胶质细胞与对照组和SCR处理组相比,朊蛋白基因的表达量显著升高。该试验结果为深入了解TSEs的分子致病机制和正常朊蛋白的功能提供了基础数据。
2008年01期 No.133 58-62页 [查看摘要][在线阅读][下载 177K] [下载次数：168 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 舒邓群;茆达干;杨利国;吴志敏;程宝;
将70只小鼠,随机分为7组,每组10只,雌雄各半。第1组为对照组,第2～4组分别肌肉注射pcS/2SS、pGM-CSF/SS和pGM-CSF加pcS/2SSDNA疫苗;第5～7组分别口服以减毒沙门氏菌为载体的pcS/2SS、pGM-CSF/SS和pGM-CSF加pcS/2SSDNA疫苗。结果表明:肌肉注射和口服pGM-CSF/SS和pGM-CSF加pcS/2SSDNA免疫小鼠均能有效激发免疫系统产生较强的免疫应答,与对照组相比,生长抑素抗体P/N值都有提高,且随着免疫时间的延长,呈现不断增高的趋势;同种疫苗以肌肉注射或口服途径免疫小鼠,血浆生长抑素抗体P/N值变化不显著;阳性鼠的比例以肌注pGM-CSF/SS为最高,达60%,pcS/2SS肌注组仅30%,其他各组分别为40%～60%,对照组没有出现阳性鼠;试验各组IgG1抗体的免疫反应高于IgG2a抗体,且IgG1的免疫反应,pcS/2SS和pGM-CSF/SS组高于pGM-CSF加pcS/2SS组;IgG2a的免疫反应,pGM-CSF/SS组高于pcS/2SS和pGM-CSF加pcS/2SS组。口服免疫组的IgG1和IgG2a免疫反应强于肌肉注射免疫组。说明基因佐剂GM-CSF可增强生长抑素基因疫苗的免疫反应,口服免疫pGM-CSF/SS、pGM-CSF加pcS/2SS可同时激发Th1型和Th2型免疫应答,GM-CSF和SS的融合表达质粒的免疫反应优于pGM-CSF和pcS/2SS的共免疫。
2008年01期 No.133 63-67+83页 [查看摘要][在线阅读][下载 229K] [下载次数：181 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 何凯;欧江涛;黄礼光;王希龙;钟金城;王峰;郑心力;
根据猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag)基因、多聚酶(pol)基因、囊膜(env)基因和β-肌动素(β-actin)基因核酸序列设计并筛选特异性引物6对,利用PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因存在情况进行系统检测;利用半定量RT-PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉7个组织中的表达情况进行系统检测与分析。结果显示,在202个被检样品中,gag、pol基因和envB基因亚型均存在,envA基因亚型仅3个样品未发现,envC基因亚型共检出34个,检出率为16.8%。所测试的7个组织均表达gag、pol和env基因序列,但envC仅在1头个体的组织中表达。各组织gag mRNA丰度以肾脏为最高,其次为肺、心、肝、脾,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织pol mRNA丰度以肾脏为最高,其次为脾、肺、肝、心,肌肉和脑组织的丰度最低。各组织envA、envB mRNA丰度信号强度分布与gag、pol信号类似,亦以肾脏为最高,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织envC mRNA的信号强度明显低于envA、envB。以上结果表明,在五指山小型猪中存在PERV,且在各组织中的表达量有差异。
2008年01期 No.133 68-71+93页 [查看摘要][在线阅读][下载 146K] [下载次数：146 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 刘俊栋;顾建红;刘海霞;段修军;刘宗平;
无菌分离、冲洗7日龄内番鸭长骨骨髓,收集、培养破骨细胞(Osteoclasts,OC)。培养过程中对照组不添加钙、磷因子,试验组加入不同浓度比例的钙磷双因子(Ca∶P分别为2∶1、1∶1、1∶2),进行破骨细胞骨髓诱导培养。倒置显微镜观察细胞形态,于培养1、3d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)计数,培养7d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝。结果显示,培养3d时试验组TRAP阳性细胞均多于对照组,差异极显著(P<0.01);试验2∶1组与1∶1组差异不显著(P>0.05),其余各组间均差异极显著(P<0.01);扫描电镜观察,象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小(2∶1、1∶1、1∶2)成反比。当钙磷比例为1∶2时,破骨细胞数量最多,功能活跃。结果表明,鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系已成功建立。
2008年01期 No.133 72-74+105页 [查看摘要][在线阅读][下载 429K] [下载次数：117 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 顾建红;刘俊栋;刘海霞;谢献胜;郑中朝;张力;刘宗平;
分离7日龄内番鸭长骨破骨细胞(osteoclast,OC),倒置显微镜观察其活体形态。培养1、3、5、7d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP),培养7d后进行骨吸收陷窝定量分析,观察番鸭OC数量、体外生存时间以及骨吸收功能。结果显示,倒置显微镜下观察,OC为多核巨细胞,有伪足并借助伪足的凹凸伸缩而改变形态、运动行走。玻片上OCTRAP染色阳性,培养7d的象牙片上产生明显吸收陷窝。直接分离OC的数量随培养时间延长而减少,单核细胞融合而成的OC数量随培养时间延长而增加;分离培养的鸭OC具有骨吸收活性,TRAP染色阳性。
2008年01期 No.133 75-78页 [查看摘要][在线阅读][下载 354K] [下载次数：188 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 李锐;周友中;肖希龙;
以天然可生物降解的明胶为载体材料,液体石蜡为油相,Span80为乳化剂,采用正交试验优化空白明胶微球的乳化法制备工艺,并在此基础上制备了恩诺沙星明胶微球。结果显示,含药微球平均粒径为12.35μm,粒径7～30μm的微球占总数的92.3%,符合肺靶向的要求。恩诺沙星明胶微球载药量为20.67%、包封率为43.62%,动态透析法研究体外释放特性,符合Higuchi规律,释药t1/2比原药延长了约6倍,表明有明显的缓释功能。在37℃、相对湿度值(RH)75%考察3月,几乎无变化。兔体内分布试验表明具有明显的肺靶向性,肺中药代动力学行为符合三室开放模型。
2008年01期 No.133 79-83页 [查看摘要][在线阅读][下载 164K] [下载次数：415 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：22 ] |[阅读次数：0 ]