预防兽医学

  • 猪圆环病毒与口蹄疫病毒二联重组鸡痘病毒的鉴定和BALB/c小鼠的免疫试验

    秦晓冰;牛晋国;杨瑞梅;韩先杰;黄娟;单虎;金宁一;

    以鸡痘病毒(FPV282E4)为活载体,用猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白、与复制相关蛋白基因及O型口蹄疫结构蛋白基因作为目的基因,经同源重组的方法获得2个重组鸡痘毒,分别命名为:vUTALP1-ORF2-ORF1、vUTALP1-ORF2。在复制、转录和翻译水平对这2个重组毒进行鉴定,结果表明这2个重组毒均能表达目的蛋白。将它们免疫6~8周龄BALB/c小鼠,每隔19d免疫1次,共3次;每10d尾跟采血1次,三免后10d杀鼠取脾。用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类CD4+、CD8+数量。结果发现2个重组毒试验免疫组均是从最后一次采集的小鼠血清能获得最高的抗体效价,与对照组FPV相比都能产生一定的体液免疫反应,且以vUTALP1-ORF2-ORF1重组毒免疫小鼠产生的血清抗体效价最高;脾T淋巴细胞亚类数量测定发现,免疫试验组的CD4+与CD8+的T细胞亚类总数显著高于对照组(P<0.05),并以vUTALP1-ORF2-ORF1数值较高。结果表明,这2个重组鸡痘毒既能较好的刺激细胞免疫又能产生一定的体液免疫,将作为候选活载体重组鸡痘毒进行本体动物免疫试验研究。

    2012年02期 v.32;No.182 161-166页 [查看摘要][在线阅读][下载 403K]
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  • 猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR-DHPLC检测新技术的建立及应用

    杨春华;祝建新;钟毅;孙思扬;沈艳;陈庆富;王川庆;

    应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),根据PRRSV GP5基因的序列特点设计特异性引物,PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测。以猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪流感病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应,具有较好的特异性和重复性;对阳性标准品的检测结果表明,所建立的PCR-DHPLC法灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。对16份疑似病料分别应用本试验所建立的PCR-DHPLC法与SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法、PCR-凝胶电泳法、病毒培养法进行检测,发现有15份荧光定量PCR阳性,15份PCR-DHPLC阳性,12份PCR-凝胶电泳阳性。结果表明,建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。

    2012年02期 v.32;No.182 167-171页 [查看摘要][在线阅读][下载 212K]
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  • 携带抗口蹄疫病毒ScFv基因猪成纤维细胞系的建立

    孙丹丹;李霄;王婧;尹熙俊;康锦丹;鲁月;李太元;金宁一;

    根据口蹄疫病毒的感染特征及其在临床发病过程中呈现的症状,筛选抗口蹄疫病毒单链抗体基因。通过EcoRⅠ/NotⅠ双酶切中间质粒pGEX-ScFv获得单链抗体基因片段,并克隆至反转录病毒载体质粒pFB-neo,构建反转录病毒穿梭载体质粒pFB-ScFv。将pFB-ScFv与辅助质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装重组反转录病毒MMLV-ScFv。同时,构建含增强型绿色荧光蛋白基因的重组反转录病毒MMLV-EGFP作为对照。利用所包装重组反转录病毒感染猪成纤维细胞,通过G418筛选获得携带目的基因的单克隆细胞集落。试验结果表明,本试验在成功构建反转录病毒穿梭载体pFB-ScFv和pFB-EGFP的基础上,获得了分别携带抗口蹄疫病毒单链抗体基因和增强型绿色荧光蛋白基因的反转录病毒,并最终筛选出分别携带上述基因的猪成纤维细胞克隆,为抗口蹄疫病毒转基因动物的研究奠定了基础。

    2012年02期 v.32;No.182 172-176页 [查看摘要][在线阅读][下载 350K]
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  • 猪瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法的建立

    郭焕成;席进;刘帅;涂长春;

    根据猪瘟病毒(CSFV)E2基因序列,设计41条针对CSFV 3个基因群共10个亚群各亚群寡核苷酸探针。利用欧盟猪瘟诊断手册推荐的CSFV E2基因套式RT-PCR方法,在内套PCR过程中进行Cy3-dCTP掺入荧光标记,制备芯片杂交样品。用标记的PCR产物与寡核苷酸探针阵列杂交,置于GenePix 4100A扫描仪中扫描,利用Ge-nePix Pro 6.0软件分析杂交图像。特异性和灵敏度试验显示,芯片方法与本室发表的CSFV real-time RT-PCR方法的灵敏度相近,芯片探针与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)样品无非特异性杂交。以包括1.1、2.1、2.2、2.3亚群的8份CSF阳性样品进行芯片的检测验证,结果表明,通过特异性的杂交图谱或杂交信号分析可准确判定样品所属的基因亚群,寡核苷酸芯片的检测结果与测序的分型结果全部符合。本研究为将寡核苷酸芯片技术用于猪瘟病毒的基因分型和分子流行病学研究奠定了基础。

    2012年02期 v.32;No.182 177-181+211页 [查看摘要][在线阅读][下载 605K]
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  • H9N2 AIV HA蛋白S145N变异毒株的抗原性和免疫原性

    王新卫;赵军;陈陆;姚惠霞;王川庆;王泽霖;

    在研究1998-2008年中国H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株HA基因的进化时,发现在25个毒株中有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生1个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H9亚型AIV的抗原性和免疫原性的影响,本试验对12株HA蛋白S145N变异的H9N2AIV进行了交叉中和试验和交叉攻毒试验。结果显示,不同H9N2S145N变异株与疫苗株间在抗原性上变化不大,或无显著差异(0.5≤R≤0.67)。但参照现有的H9灭活疫苗效力检验方法对HP疫苗免疫鸡进行攻毒,用HP株攻毒对照组0/5保护,免疫组保护≥9/10,达到了H9灭活疫苗质量标准要求;但用S145N变异株N3攻毒,仅保护2/10~6/10,且随免疫量剂量的增加,抗体水平的提高,攻毒保护也依次升高。对H9变异株疫苗(N1、N2、N3、N8)免疫鸡用N3攻毒,仅保护2/5~4/5,N3同源抗体也不能有效地阻止其攻毒后的排毒。用N3、N6 2个变异株交叉攻毒,采用与疫苗株攻毒相同的剂量作攻毒试验也得到类似结果。表明高于6log2的抗体能抵抗疫苗株和大多数流行毒株攻毒后的排毒,但不能抵抗S145N变异株攻毒后的排毒。这类毒株免疫原性上的变化与病毒HA基因的变异密切相关。因HA基因145~147aa位增加了1个NGT,导致三维空间构象的变化,并影响其邻近的受体结合位点,从而使这类毒株致病性提高,免原性发生改变。虽然这一类变异株或免疫逃逸毒株仅占当前流行毒株总数的5%~7%,但在强大的免疫压力和自然选择下有可能逐步成为优势毒株,造成更大的危害,这为该病的防控提出了新的挑战。

    2012年02期 v.32;No.182 182-188页 [查看摘要][在线阅读][下载 171K]
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  • 纳米氢氧化铝吸附禽流感病毒灭活疫苗的研制及其对肉鸡抗体效价的影响

    徐爱平;黎晓敏;

    自制纳米氢氧化铝佐剂,通过吸附H5N1灭活抗原,制备了纳米铝佐剂疫苗,按照中华人民共和国农业行业高致病性禽流感免疫技术规范标准,免疫肉鸡。经检测发现纳米铝佐剂疫苗组肉鸡产生有效保护抗体时间较油佐剂疫苗和常规铝佐剂疫苗提前3d和7d,抗体峰值达到时间较油佐剂疫苗和常规铝佐剂疫苗提前14d。结果表明,纳米氢氧化铝作为高致病性禽流感H5N1的免疫佐剂,可以更早的刺激动物产生有效保护抗体,纳米铝佐剂禽流感疫苗具有广泛的应用价值。

    2012年02期 v.32;No.182 189-195页 [查看摘要][在线阅读][下载 270K]
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  • 白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

    潘素敏;李秀锦;仲飞;柳新保;韩冬梅;王幸兴;潘宏丽;王微;

    犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12(IL-12)基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基(P40)和小亚基(P35)cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点(IRES)序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12(P40和P35双亚基)基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫(用pcDNA3.1A作为对照)。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组(P<0.01),抗体水平在第35天高达1:5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组(P<0.05)。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。

    2012年02期 v.32;No.182 196-201页 [查看摘要][在线阅读][下载 360K]
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  • 肝癌细胞靶向肽的筛选与鉴定

    赵红蕾;韩文瑜;刁昱文;冯新;韩东;朱僧;刘晓贺;路荣;雷连成;

    利用噬菌体环七肽库筛选与肝癌细胞特异性结合的多肽,并对其亲和力进行生物学鉴定。以HL-7702为消减细胞,HepG2为筛选靶细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮全细胞消减筛选,并随机挑取60个阳性噬菌体克隆,以ELISA法鉴定其与HepG2细胞的结合活性,并取阳性克隆进行测序分析,并合成多肽进行免疫细胞化学染色鉴定。经4轮筛选,噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集;利用ELISA从随机挑选的60个噬菌体克隆中得到15个与肝癌细胞具有高结合力的阳性克隆,测序并进行序列分析比对发现氨基酸序列无同源性,经免疫细胞化学染色鉴定后,发现1条多肽序列亲和力较高,为提高抗菌肽对肿瘤细胞的靶向杀伤作用奠定基础。

    2012年02期 v.32;No.182 202-206页 [查看摘要][在线阅读][下载 325K]
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  • 2株鸡源沙门菌主要表观性状及16S rRNA基因系统发育研究

    房海;陈翠珍;史秋梅;张艳英;马增军;张东林;王秋悦;

    对分离于发病死亡鸡的12株沙门菌(Salmonella),进行了形态特征、理化特性、血清型、致病作用、药物敏感性等主要表观性状及系统发育的研究。其中包括O4(B)群无动力沙门菌(Salmonellagroup B O form)2株(EU073022),血清型1,4,5,12:-:-;鸡沙门菌(S.gallinarum)2株(EU073018),血清型1,9,12:-:-;病牛沙门菌(S.bovismorbificans)5株(EU073019),血清型6,8:r:1,5;肠炎沙门菌(S.enteritidis)3株(EU073020),血清型1,9,12:g,m:-。人工感染试验表明,均具有较强的致病作用;药物敏感性试验结果显示,在不同菌株间的敏感、耐药等差异不明显。

    2012年02期 v.32;No.182 207-211页 [查看摘要][在线阅读][下载 294K]
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  • 副猪嗜血杆菌OMP P2基因的克隆与表达

    李鹏;李军星;曹珺;张国龙;李玉峰;宋艳华;王先炜;姜平;

    利用已分离的菌株HB070412,根据NCBI上GenBank中的HPS序列(ZP_02477753)设计了1对引物,用PCR方法扩增了副猪嗜血杆菌外膜蛋白中的穿孔素前体蛋白P2基因(OMP P2),并克隆到载体pMD18-T(T-Vec-tor),序列测定结果表明OMP P2基因全长1 077bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与所报道的HPS OMPP2基因之间的核苷酸序列同源性为98.1%,氨基酸序列同源性为95.5%。用pGEX-6p-1构建了原核表达载体pGEX-P2,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的50%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约为65 000,Western blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。

    2012年02期 v.32;No.182 212-215页 [查看摘要][在线阅读][下载 213K]
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  • 微生态制剂对肉鸡代谢和免疫系统的影响

    赵建文;周明东;周霞;张海滨;王春民;乔昌明;岳寿松;赵宏坤;

    本研究旨在观察一种由多种有益菌组成的微生态制剂(主要成分为乳酸杆菌和芽孢杆菌等)通过饮水摄入以后,对鸡舍氨气浓度,肉鸡血清中血氨、血清尿酸、总蛋白、白蛋白和球蛋白含量和免疫系统的影响。选用240只1日龄AA肉鸡,按试验需求随机分成4个试验组,即对照组、试验1组、试验2组和试验3组。每个试验组3次重复,每次重复20只。从1日龄开始,对照组按正常饮水,其余各组均在饮水中添加该液态微生态制剂,添加量分别为试验1组0.3%,试验2组0.6%,试验3组1.2%。结果表明,试验2组在第6周可显著降低鸡舍内的氨气浓度(P<0.05)。各试验组血清总蛋白、球蛋白含量均显著高于对照组(P<0.05)。试验1组肉鸡免疫后的抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。结果提示,适量添加该微生态制剂能在一定程度上降低鸡舍氨气浓度,使机体血液中总蛋白、球蛋白含量升高。同时可以增强机体体液免疫能力,但对细胞免疫的影响效果不显著。

    2012年02期 v.32;No.182 216-219页 [查看摘要][在线阅读][下载 119K]
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  • 牛新孢子虫NcSRS2基因腺病毒穿梭载体的构建及在293细胞中的表达

    贾立军;张守发;刘明明;

    应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2(AF061249)核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。

    2012年02期 v.32;No.182 220-222+227页 [查看摘要][在线阅读][下载 207K]
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  • 柔嫩艾美耳球虫石家庄株的生物学特性与抗药性研究

    李蕴玉;李佩国;张香斋;张艳英;张文香;贾青辉;陈娟;

    用5×104个柔嫩艾美耳球虫石家庄株孢子化卵囊感染14日龄雏鸡,对卵囊潜隐期、最早孢子化时间、形态及大小等生物学特性进行了测定。并以最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)和抗球虫指数(ACI)为指标,检测了常用抗球虫药对其敏感性。结果表明:(1)该虫株寄生于盲肠,呈宽卵圆形,壁光滑,分2层,多数可见极粒。卵囊大小范围为(19.68~27.76)μm×(15.21~23.99)μm,平均大小为(23.41±2.22)μm×(19.34±2.27)μm,卵囊指数1.21。孢子囊大小范围为(8.30~14.28)μm×(4.05~9.15)μm,平均大小为(11.69±1.53)μm×(6.74±1.26)μm,孢子囊指数1.73。潜隐期和最短孢子化时间分别为133h和20h。(2)该虫株对马杜霉素、克球粉与球敌呈完全抗药性;对瑞冠球呈轻度抗药性;而对氨丙啉和金三特无抗药性。

    2012年02期 v.32;No.182 223-227页 [查看摘要][在线阅读][下载 136K]
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  • 新疆牛双芽巴贝斯虫病的流行病学调查

    简子健;马素贞;孙其喆;沈炯玉;吕伟;苗中秋;

    本研究使用牛双芽巴贝斯虫HSP20(exon)-iELISA检测方法,对2006-2008年新疆14个地州市的牛双芽巴贝斯虫病流行病学进行了调查。结果显示:(1)新疆存在着牛双芽巴贝斯虫病,且比牛巴贝斯虫病严重。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清11份,感染率为5.40%。2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清25份,感染率为4.70%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清53份,感染率为7.17%;(2)2008年,发病疫区内牛双芽巴贝斯虫感染率高达30%;(3)牛双芽巴贝斯虫感染的地州市由2006年的8个扩大到2008年的13个;(4)新疆牛双芽巴贝斯虫病的感染率逐年上升,疫区面积不断扩大,流行区内感染率激增。这是新疆首次利用血清学方法对全疆范围内牛双芽巴贝斯虫病进行大规模的流行病学调查。

    2012年02期 v.32;No.182 228-230+247页 [查看摘要][在线阅读][下载 206K]
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人兽共患病

  • 猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段的表达、纯化及抗原性分析

    郝宝成;梁剑平;兰喜;刑小勇;项海涛;温峰琴;胡永浩;柳纪省;

    根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因(ORF2)的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插入的片段属于猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因ORF2部分;将该片段插入pet32a表达载体,经酶切、测序鉴定证实获得了带有目的基因的重组表达质粒。将重组质粒转化Rosetta菌,经0.3mmol/L IPTG诱导得到融合表达,得到相对分子质量为45 000的重组蛋白,以包涵体形式存在。Western blot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。并用SDS电泳切胶纯化和透析浓缩方法进行纯化,用纯化的蛋白免疫兔子,经每2周免疫1次,连续3次免疫后,对免疫组和对照组,分别在45,60,90d采血,每只兔子采集1份。用夹心ELISA法测定免疫血清抗体,结果表明免疫组在45d后均产生具有HEV抗原结合活性的抗体。本试验对猪swCH189株CP239基因的克隆和表达研究,为进一步研究结构蛋白基因ORF2的生物学功能奠定了基础。

    2012年02期 v.32;No.182 231-237页 [查看摘要][在线阅读][下载 338K]
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  • 猪戊型肝炎病毒ORF2-62的克隆、表达及间接ELISA方法的初步建立

    王永霞;郝成武;马勋;

    为了获得具有反应原性的重组蛋白,以该蛋白建立初步的间接ELISA检测方法。本研究通过RT-PCR从猪粪便中克隆了戊型肝炎病毒(HEV)ORF2与急性期血清反应的抗原决定簇基因片段,将该片段插入pET-32a表达载体,命名为pET32a-ORF2-62,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用1.0mmol/L IPTG进行诱导表达,通过Western-blotting检测其反应原性,并利用镍柱亲和层析纯化所获目的蛋白。结果,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为30 600,Western-blotting显示重组蛋白与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。经方阵滴定确定最佳包被浓度为7.7mg/L,血清最佳稀释比为1∶40。利用大肠杆菌表达的HEV重组蛋白建立了间接ELISA检测方法,此方法的建立为戊型肝炎早期诊断提供了一种快速简便的血清学诊断方法。

    2012年02期 v.32;No.182 238-241页 [查看摘要][在线阅读][下载 226K]
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  • 广东地区患病食品动物源大肠杆菌ESBLs和AmpC酶流行分布调查

    汤电;张浩吉;纪雪薇;刘继;郭玉芳;王丽华;付晓平;张小华;孙永学;蒋红霞;

    质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶广泛传播和扩散,导致全球范围内肠杆菌科细菌对超广谱头孢菌素类的耐药性发展迅速,引起人们高度重视。食品动物源大肠杆菌可作为耐药基因储库,对细菌耐药性在动物、环境和人之间的传播起着非常重要的作用。本研究从2009年患病的食品动物,包括鸡、鸭、鹅和猪,分离鉴定了315株大肠杆菌,调查ESBLs和AmpC酶在患病食品动物中的流行分布。经双纸片协同扩散实验筛选出61株ESBL阳性菌株,PCR检测共检测出8种blaCTX-M基因,分别为blaCTX-M-14/14b、blaCTX-M-79、blaCTX-M-65、blaCTX-M-27、blaCTX-M-15、blaCTX-M-24、blaCTX-M-98和blaCTX-M-13,其中检出率最高的为blaCTX-M-79,其次为blaCTX-M-14/14b。本研究还检测出1株新的SHV型酶,命名为SHV-135;PCR共检测出5株大肠杆菌携带质粒源CMY-型AmpC酶,其中2株鹅源大肠杆菌携带1个新型CMY酶,命名为CMY-64。本研究表明患病动物分离的大肠杆菌中ESBLs和AmpC酶存在复杂性和多样性,而且新型β-内酰胺酶检出日益增多,提示兽医临床应慎用β-内酰胺类抗生素。

    2012年02期 v.32;No.182 242-247页 [查看摘要][在线阅读][下载 226K]
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  • 兔巴氏杆菌和波氏杆菌多重PCR检测方法的建立

    刘燕;韦强;肖琛闻;鲍国连;季权安;庞安娜;

    参考GenBank中兔巴氏杆菌16SrRNA和波氏杆菌的fim2的基因序列,应用Premier 5.0软件在二者高度保守区设计了2对引物,建立了适合巴氏杆菌和波氏杆菌快速检测的多重PCR检测方法。以该方法对巴氏杆菌和波氏杆菌参考菌株进行PCR扩增,分别能从各自的基因组中扩增出与试验设计相符的644bp和425bp的特异性DNA片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果表明分别为巴氏杆菌16SrRNA和波氏杆菌fim2基因序列。该方法对波氏杆菌的检测下限为4×102 CFU,对巴氏杆菌的检测下限为6×101 CFU。对兔源性沙门菌、葡萄球菌、大肠杆菌、魏氏梭菌扩增结果为阴性。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于鉴别诊断兔巴氏杆菌和波氏杆菌以及2者混合感染。

    2012年02期 v.32;No.182 248-251页 [查看摘要][在线阅读][下载 275K]
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  • 弓形虫感染鼠脾细胞microRNA表达谱的检测分析(英文)

    金洪涛;商立民;刘全;

    MicroRNA(miRNA)是一类约22个核苷酸组成的单链非编码RNA,在分化、发育、肿瘤形成等方面起着重要作用。本研究对弓形虫RH株感染小鼠脾细胞miRNA的表达进行了特异性基因芯片检测分析,并应用荧光定量RT-PCR方法进行验证。结果表明,感染鼠脾细胞中与免疫应答及细胞增殖和肿瘤发生相关的三大类miRNA中,有39种表达下调,同时有36种表达上调。上述结果揭示,弓形虫感染机体后伴随着靶细胞功能性miRNA表达谱的显著改变,这为进一步研究弓形虫感染致病的分子机制开辟了新的方向。

    2012年02期 v.32;No.182 252-257页 [查看摘要][在线阅读][下载 179K]
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  • 湖南省猬迭宫绦虫的线粒体nad5和rrnS基因的序列测定及种系发育分析

    刘自逵;赵光辉;刘国华;宋海燕;李芬;刘毅;

    本研究旨在阐明猬迭宫绦虫湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)和核糖体小亚基基因(rrnS)部分序列(prrnS)的遗传变异情况,并用pnad5和prrnS序列重构猬迭宫绦虫与其他绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增猬迭宫绦虫的pnad5和prrnS,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mega4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树。结果显示,所获得的pnad5和prrnS序列与预期(片段的)长度一致,分别为531bp和328bp。种系发育树表明,湖南分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分枝。结果表明,由于猬迭宫绦虫pnad5和prrnS序列种内相对保守,种间差异较大,均可作为种间遗传变异研究的标记。

    2012年02期 v.32;No.182 258-261页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K]
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基础兽医学

  • 猪FcRn胞浆尾区的克隆表达及多克隆抗体制备

    崔惠娟;洪素梅;陈志虎;毕丁仁;李自力;

    采用RT-PCR方法从猪肝脏总RNA中克隆猪FcRn基因,然后利用PCR技术亚克隆猪FcRn胞浆尾区(FcRn-CT),构建重组原核表达质粒KG-CT和pET32a-CT,分别在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,并利用Glutathione Sepharose 4B和HisTrap FF crude亲和层析柱纯化目的蛋白。用纯化蛋白KG-CT免疫新西兰白兔,制备了多克隆抗体。利用纯化蛋白pET32a-CT建立了间接ELISA法,检测多抗效价达1∶32 000。Western blot检测结果表明该多抗特异性良好,为进一步研究FcRn在猪体内的表达分布及功能研究奠定了基础。

    2012年02期 v.32;No.182 262-266+271页 [查看摘要][在线阅读][下载 510K]
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  • 毕赤酵母表达铜锌超氧化物歧化酶中试工艺研究

    迟春萍;陈子杨;徐军;时成波;曹玉峰;李铮;贾媛;李雨桐;郭立君;田海山;王小杰;孙彪;翟东;冀长发;李校堃;

    正交设计优化铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母在摇瓶及30L发酵罐的诱导表达条件,用两步层析法纯化表达的目的蛋白,在不同温度下进行原液稳定性试验。用考马斯亮蓝检测蛋白含量,活性检测试剂盒检测目的蛋白活性。纯化后原液参照中华人民共和国药典三部2005版进行检测,用SDS-PAGE、HPLC检测纯度,免疫印迹法检测rhCu,Zn-SOD特异性,等点聚焦测定该酶等电点,地高辛法检测残余DNA含量,酶联免疫法测定残余蛋白含量。结果显示正交试验的大罐高密度发酵最适条件比摇瓶的最适条所获得的目的蛋白活性高8倍,纯化后,HPLC纯度为99.7%,原液比活性大于6.0×103 U/mg,各项检测指标达到生物制品检定标准。该酶在45、65、85、100℃的半衰期分别为240、120、30、15。具有良好的酶稳定性。本研究建立了发酵、纯化的中试工艺,获得高表达、高纯度及高比活的铜锌超氧化物歧化酶,为规模化生产奠定了基础。

    2012年02期 v.32;No.182 267-271页 [查看摘要][在线阅读][下载 180K]
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  • 盐酸沃尼妙林预混剂在猪组织中残留消除规律研究

    张盈盈;陈小秋;李朋朋;陈翠兰;王铭宏;王春梅;李晶;齐元花;易维学;操继跃;

    建立了猪肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中盐酸沃尼妙林的高效液相色谱检测方法并研究盐酸沃尼妙林预混剂在猪体内各组织中的残留消除规律。对24头健康猪以200mg/kg的剂量混饲给药21d。在停药后0、6、12、18、24、36h分别宰杀4头猪,采集各组织进行药物残留测定。方法的检测限为0.025~0.062 5μg/g,定量限为0.05~0.1μg/g,肝脏的平均回收率为75.5%~76.4%,变异系数为2.3%~3.8%;肾脏的平均回收率为75.8%~78.5%,变异系数为4.1%~6.0%;肌肉的平均回收率为79.3%~80.0%,变异系数为3.0%~4.7%;脂肪的平均回收率为76.7%~77.3%,变异系数为3.3%~5.4%。结果表明,盐酸沃尼妙林在肝脏中残留量最高,肾脏其次;肌肉和脂肪中的残留量显著低于肝脏和肾脏,停药24h时,残留量低于定量限;停药36h时残留量均低至检测限以下。盐酸沃尼妙林预混剂在猪组织中消除迅速,建议休药期为2d。

    2012年02期 v.32;No.182 272-276页 [查看摘要][在线阅读][下载 346K]
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  • 三聚氰胺在中华鳖组织中的代谢动力学研究

    何欣;张海琪;施礼科;梁丽军;姚高华;

    应用液相色谱-串联质谱监测技术研究了三聚氰胺药饵多次给药后在中华鳖体内的药物代谢动力学。结果表明,中华鳖血液、肝脏、肌肉中三聚氰胺浓度分别在8、4、2h时达到高峰;最高峰时血液、肝脏、肌肉中药物质量浓度平均分别为16.98、16.79和12.05mg/kg。在血液、肝脏和肌肉组织中三聚氰胺浓度的t1/2(ke)分别为24.11、107.75和36.49h。三聚氰胺在血液、肝脏、肌肉组织中的代谢过程均符合一室模型,相应的动力学方程分别为:C血液=17.08×(e-0.0287t-e0.0558t),C肌肉=11.64×(e-0.0190t-e2.1425t),C肝脏=15.72×(e-0.0064t-e2.5558t)。说明药饵给药后三聚氰胺在中华鳖体内消除较慢。

    2012年02期 v.32;No.182 277-280页 [查看摘要][在线阅读][下载 125K]
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  • β-羟丁酸抑制下丘脑神经细胞PIF基因表达和蛋白分泌

    付守鹏;李苏楠;李洋;李志强;杨占清;陈巍;王玮;柳巨雄;

    分离培养Wistar新生大鼠的下丘脑神经细胞,在培养第7天以不同浓度的β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA)(0、0.05、0.5、1、2mmol/L)处理24h,收集上清和细胞,提取细胞总RNA,分别利用荧光定量RT-PCR和ELISA的方法检测催乳素释放抑制因子(Prolactin release-inhibiting factor,PIF)基因表达和蛋白分泌的变化。结果显示,BHBA能显著抑制PIF基因表达和蛋白分泌,而且具有剂量依赖性。结果表明,BHBA可能做为信号分子调节下丘脑的分泌功能。

    2012年02期 v.32;No.182 281-284+289页 [查看摘要][在线阅读][下载 255K]
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  • MNC驱饲料铅对猪免疫和抗氧化性能的影响

    余东游;王玥;饶巍;

    以纳米蒙脱石(MNC)为吸附材料,重金属铅为吸附对象,以"杜长大"三元杂交猪为试验动物,研究了MNC驱铅对生长肥育猪机体免疫与抗氧化性能的影响。免疫学指标测定结果表明,与10mg/kg铅组比较,10mg/kg铅+0.5%MNC组猪的胸腺、脾脏系数分别减少了27.97%(P<0.01)、12.37%(P<0.05),T-淋巴细胞转化力、血清IgG、IgM水平分别提高了17.89%(P<0.05)、16.20%(P<0.05)、14.46%(P<0.05)。试验各组的IgA水平均未发生显著性变化(P>0.05)。抗氧化能力研究表明,与对照组相比,加MNC组猪血清与肝脏中MDA含量显著降低(P<0.05),CTA、SOD、GSH-Px活力均显著提高(P<0.05);与10mg/kg铅组比较,添加10mg/kg铅+0.5%MNC组猪血清和肝脏中MDA含量明显下降(P<0.05),CTA、SOD、GSH-Px活力明显上升(P<0.05)。此外,饲料中添加MNC后显著提高了猪肝脏中MT、K+,Na+-ATPase和Ca2+,Mg2+-ATPase酶活(P<0.05)。结果表明,MNC能有效吸附饲料中的铅,阻断铅经消化道进入动物体内,改善猪的免疫与抗氧化性能。

    2012年02期 v.32;No.182 285-289页 [查看摘要][在线阅读][下载 140K]
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  • 百日鸡J-亚群禽白血病组织病理学与超微病理学研究

    尹青;孙淑红;柴家前;郭慧君;崔治中;

    利用ELISA试剂盒,对百日鸡的禽白血病抗体和抗原进行了检测。在5个百日鸡父母代鸡群中,1个鸡群的ALV-J抗体阳性率为57.14%,其余鸡群皆为阴性;所有鸡群的ALV-A、B抗体均为阴性;ALV p27抗原除1个鸡群为阴性外,其余鸡群阳性率都较高。在百日鸡的J亚群禽白血病病例中,肝脏、脾脏和肾脏显著肿大,且有弥漫性分布的肿瘤结节;在其他脏器也呈现肿瘤结节。组织病理学观察,发现其脏器等组织中,有一定比例的胞质含红色嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞与成淋巴细胞,排列致密呈局灶性生长,正常的组织细胞被挤压或破坏。超微病理观察,在脾脏和法氏囊等组织中均看到病毒颗粒,有囊膜,直径约100nm。部分淋巴细胞核膜、细胞膜水肿或溶解破裂,线粒体和内质网也水肿或池变大、细胞质中出现很多空泡状结构。肿瘤细胞的增多以及细胞内和细胞间的水肿,可能是各脏器严重肿大的主要原因。

    2012年02期 v.32;No.182 290-295页 [查看摘要][在线阅读][下载 1366K]
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临床兽医学

  • 敌百虫对体外培养大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的影响

    刘学忠;李丹;袁燕;顾建红;刘宗平;

    为探讨敌百虫对大鼠大脑皮质神经细胞的毒性作用及机理,本研究在建立体外培养新生24h内SD大鼠大脑皮质神经细胞模型的基础上,在细胞培养液中添加0、5、20、80mg/L敌百虫染毒,在染毒后的不同时间测定细胞凋亡率、线粒体膜电位、细胞内[Ca2+]i、ROS含量和ATP酶的变化。结果显示:①染毒12h,细胞凋亡率明显增加;②染毒12h,各染毒组线粒体膜电位逐渐降低,其中80mg/L组与对照组存在极显著差异(P<0.01);③染毒0.5h,各染毒组细胞内[Ca2+]i显著高于对照组(P<0.01);染毒12h,各染毒组细胞内[Ca2+]i呈下降趋势,但仍显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);④染毒12h和24h,细胞内ROS水平显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);⑤染毒12h,细胞Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性逐渐降低,20、80mg/L组与对照组有极显著差异(P<0.01);上述指标的变化呈显著的剂量-效应关系。结果表明,低质量浓度敌百虫暴露可致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡率和细胞内ROS含量升高,线粒体膜电位下降,细胞内钙离子超载且ATPase活性降低,提示细胞凋亡在敌百虫所致的大脑皮质神经细胞损伤过程中发挥主导作用。

    2012年02期 v.32;No.182 296-300页 [查看摘要][在线阅读][下载 293K]
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  • 组织块再移法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞

    陈秋菊;王韵斐;崔易虹;朱广琴;宋宇轩;曹斌云;

    通过比较组织块贴壁培养法、组织块再移法、胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶消化配合组织块贴壁法分离、培养、纯化山羊乳腺上皮细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,研究乳腺上皮细胞培养效果。结果显示,利用胶原酶消化配合组织块贴壁法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞;利用组织块贴壁培养法、组织块再移法和胶原酶Ⅱ消化法获得大量的乳腺上皮细胞,所得到的上皮细胞生长曲线呈典型的"S"型,符合细胞生长的一般规律。组织块再移法不仅可快速获得大量纯化的乳腺上皮细胞,而且所得到的细胞经传代后,细胞群体倍增时间最短、增殖能力最强,表明,该法是获得山羊乳腺上皮细胞最适宜的方法。

    2012年02期 v.32;No.182 301-304页 [查看摘要][在线阅读][下载 336K]
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  • 芽孢杆菌发酵五味子提取液对肉鸡肝损伤的影响

    白华;蔡亚娜;胡明;杜加法;刘玉庆;

    为探索中药与益生菌联用治疗肉鸡肝损伤的新方法,从而改善畜禽"亚健康",本研究以CCl4注射肉鸡,建立肝损伤模型,并利用芽孢杆菌发酵五味子提取液,将发酵提取液混饮肝损伤肉鸡,检测外周血谷草转氨酶(Aspar-tate transaminase,AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、过氧化物岐化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)含量,并进行组织病理学观察。结果显示,芽孢杆菌在五味子提取液与培养基1∶1(V/V)混合液中生长良好,五味子有效成分在发酵前后含量无明显变化,发酵提取液按0.5%、1%混饮7d后,与肝损伤阳性对照组相比,2个用药组AST(P<0.05)、ALT(P<0.05)、SOD(P<0.05)、GR(P<0.01)含量显著升高,MDA(P<0.05)含量显著降低,肝脏病变较轻。结果表明,芽孢杆菌发酵五味子提取液对提高机体抗氧化能力具有一定的作用,能够治疗肉鸡肝损伤。

    2012年02期 v.32;No.182 305-308+320页 [查看摘要][在线阅读][下载 474K]
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动物科学

  • 卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗免疫对大鼠卵巢和生殖激素的影响

    王水莲;薛立群;刑朝芳;陈小军;崔先利;杨利国;

    将50只大鼠随机分为5组,分别注射0.2(T1)、0.6(T2)、1g/L(T3)pEGISI,100μg空载体pEGFP-N1(C1)和100μL生理盐水(C2),以探讨在没有使用免疫佐剂的情况下,抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI免疫对大鼠卵巢和生殖激素的影响。研究结果,加强免疫能提高抗体P/N值,T3组在加强免疫期与对照组差异显著(P<0.05);加强免疫第2周时T3组抗体阳性鼠比例达40%,与T1和T2组差异均显著(P<0.05)。T3组卵巢大小和卵泡数均显著高于对照组(P<0.05),但抗体阳性鼠大卵泡数与阴性鼠差异不显著(P>0.05)。各剂量组促卵泡素和雌二醇均高于对照组,且在加强免疫第2周时T3组与对照组差异显著(P<0.05);各剂量组孕酮含量与对照组差异均不显著(P>0.05)。结果表明,在没有使用免疫佐剂的前提下,抑制素pEGISI基因免疫可产生抗体,促进卵巢发育和FSH分泌。本试验条件下100μg是最佳免疫剂量。

    2012年02期 v.32;No.182 309-313页 [查看摘要][在线阅读][下载 297K]
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  • 人神经母细胞瘤细胞异种克隆胞质受体的选择

    刘红波;吕培茹;王献伟;杨小淦;秦小娥;宁淑芳;韩晓慧;陆阳清;卢晟盛;卢克焕;

    本研究检测人神经母细胞瘤细胞-水牛和人神经母细胞瘤细胞-猪重构胚胎的体外发育潜能,以期建立人神经细胞母细胞瘤细胞的异种治疗性克隆模型,为进一步研究人癌症发生过程中的表观遗传学修饰机制及分离得到正常的人类胚胎干细胞奠定基础。分别以水牛颗粒细胞和人神经母细胞瘤细胞为供体,水牛卵母细胞为受体构建克隆胚胎,然后检测这2种重构胚胎的体外发育效率;再以猪卵母细胞为胞质受体,同样以上述2种体细胞为供体细胞构建重构胚胎。结果显示,人神经母细胞瘤细胞-水牛重构胚胎囊胚发育率显著低于水牛同种克隆胚胎的(1.1%∶12.1%,P<0.05),而融合率(83.7%∶79.4%,P>0.05)和卵裂率(55.8%∶58.2%,P>0.05)无显著差异。但是,当以猪卵母细胞为受体胞质时,人-猪重构胚胎卵裂率显著低于水牛-猪重构胚胎(43.7%∶89.8%,P<0.05),但重构胚胎融合率和囊胚率差异不显著(85.8%∶82.5%,0∶1.4%,P>0.05)。结果表明,人神经母细胞瘤细胞-水牛和人神经母细胞瘤细胞-猪异种重构胚胎可以在体外发育,尽管其囊胚发育率相对比较低。

    2012年02期 v.32;No.182 314-320页 [查看摘要][在线阅读][下载 584K]
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  • 梅花鹿鹿茸异位生长研究

    高志光;杨福合;邢秀梅;高颂;赵桂炎;

    为了揭示鹿茸发生机理,阐明生茸区骨膜在鹿茸发生中的作用,选择4只1周岁雄性梅花鹿,在鹿茸发生前,通过外科手术将一侧完整的生茸区骨膜摘除并移植到额骨上。结果,摘除骨膜的生茸区没有发生鹿茸,而在被移植的额骨部位上发生了鹿茸且生长发育正常。证明了生茸区骨膜是鹿茸发生的组织基础,同时为通过异位生茸提高鹿茸产量开辟了新的途径。

    2012年02期 v.32;No.182 321-324页 [查看摘要][在线阅读][下载 590K]
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综述

  • WT1基因组蛋白乙酰化修饰对细胞核重编程的影响

    高飞;刘丽梅;安培培;谭文涛;唐博;李子义;

    利用体细胞移植技术获得克隆动物的成功是几十年来生命科学领域取得的重大突破之一,这项技术引起了社会的广泛关注。然而,由于哺乳动物克隆效率低下,且克隆后代发育异常等问题,已成为目前制约动物克隆技术发展和应用的瓶颈。克隆动物中经常出现后代过大综合征(LOS),该病导致克隆动物早产、难产和易夭折。LOS类似于人的伯-伟综合征(BWS),BWS也称为Wlims瘤,表现为巨舌、内脏肿大等症状。研究发现BWS的发病机理与WT1基因(Wilms’tumor 1gene)异常表达有关。本文对体细胞核重编程和表观遗传学调控细胞重编程的研究进展进行综述,并对WT1基因组蛋白乙酰化修饰与体细胞重编程之间的联系进行简要介绍,以期为生命科学领域的进一步探索与研究提供借鉴。

    2012年02期 v.32;No.182 325-328页 [查看摘要][在线阅读][下载 137K]
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