- 宋建领;高华峰;信爱国;李华春;
根据GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列,设计1对特异性引物和1条探针,以ABI公司PRRSV RNA为标准品,优化了PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法,25μL反应体系引物prrsv-f/prrsv-r(20μmol/L)各0.5μL,探针prrsv-p(10μmol/L)0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间具有良好的线性相关性。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株,与其他主要猪病病原检测无交叉反应;针对PRRSV RNA标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数为0.74%～1.52%。用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对40份临床样品检测,与商品化试剂盒检测结果完全一致。
2012年04期 v.32;No.184 497-500页 [查看摘要][在线阅读][下载 149K] [下载次数：272 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：2 ] - 宁淑芳;李青洋;梁明明;许惠艳;杨小淦;陆阳清;卢晟盛;卢克焕;
根据GenBank中公布的猪Oct4核苷酸序列设计合成1对引物,采用RT-PCR方法从巴马小型猪睾丸组织扩增Oct4基因编码全序列。然后将该基因重组于含有绿色荧光报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-Oct4重组质粒,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明重组质粒构建成功。使用脂质体2000将pEGFP-Oct4转染巴马小型猪肾脏成纤维细胞,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染细胞株中可检测到Oct4的转录。结果表明,成功构建了真核表达载体pEGFP-Oct4,并可在巴马小型猪肾脏成纤维细胞中表达,为进一步研究Oct4基因生物学功能奠定了基础。
2012年04期 v.32;No.184 501-504+520页 [查看摘要][在线阅读][下载 204K] [下载次数：144 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 李月红;付云红;陈奇;王永志;扈荣良;
采用RT-PCR方法扩增鲤鱼春季病毒出血症病毒(SVCV)的糖蛋白(G)基因,将PCR产物插入到杆状病毒转移载体pFastBac 1中,获得重组转移载体pFastBac 1-G,将其转化入含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含有G基因的重组穿梭质粒rBacmid-G。在脂质体转染试剂的介导下,将rBacmid-G转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。提取重组杆状病毒基因组,用M13引物PCR鉴定。对重组杆状病毒感染的sf9细胞,通过电镜观察、SDS-PAGE、Western blotting进行检测,结果表明,重组蛋白在sf9细胞中获得正确表达,相对分子质量约58 000,与鼠抗SVCV阳性血清具有良好的反应原性。本试验为研究鲤鱼春季病毒出血症病毒G蛋白的生物学活性和亚单位疫苗的研制奠定了基础。
2012年04期 v.32;No.184 505-508页 [查看摘要][在线阅读][下载 439K] [下载次数：149 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 王兴龙;郝华芳;杜恩岐;唐文雅;张鹏;陈胜利;张渭东;张淑霞;党如意;杨增岐;
为了方便鸡粒细胞/巨噬细胞集落细胞刺激因子(GM-CSF)作为疫苗佐剂使用,用PCR方法扩增出鸡GM-CSF基因,将其连入人腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,将重组穿梭载体与腺病毒骨架重组后,获得重组腺病毒骨架载体,线性化后转染293SD细胞,获得能够表达鸡GM-CSF的腺病毒。将获得的重组腺病毒转导鸡成纤维细胞系DF1,细胞培养上清中,可以检测到GM-CSF刺激鸡骨髓细胞活性,为鸡GM-CSF进一步应用奠定了基础。
2012年04期 v.32;No.184 509-512页 [查看摘要][在线阅读][下载 227K] [下载次数：209 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：2 ] - 谷长勤;谢长清;毕丁仁;胡薛英;张万坡;程国富;
人工感染4日龄雏鸭病毒性肝炎模型,探讨一氧化氮合酶(NOS)和NO在Ⅰ型鸭肝炎病毒感染后的肝脏中的动态变化及与肝损伤的关系。120羽4日龄雏鸭随机分为试验组和对照组,试验组腿部肌注Ⅰ型鸭肝炎病毒,对照组注射等量生理盐水。感染后动态观察肝脏的病变、测定肝组织内NOS活性和NO的浓度以及肝组织内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的分布规律。结果显示,病毒感染后,雏鸭肝功能和肝脏结构都受到不同程度的损害;NO对肝脏的损伤在感染后3d内持续增强,从4d开始逐渐减弱;iNOS主要存在于雏鸭的巨噬细胞中,其含量在感染早期上升,后期逐渐下降;肝组织内NOS活性及NO的浓度变化与免疫组化显示结果一致。结果表明,鸭肝炎病毒感染的雏鸭肝脏的损伤程度与NOS、NO浓度变化一致,提示NO在鸭肝炎病毒导致的雏鸭肝损伤中起重要作用。
2012年04期 v.32;No.184 513-516+524页 [查看摘要][在线阅读][下载 779K] [下载次数：179 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：2 ] - 唐熠;刁有祥;高绪慧;于春梅;张大丙;岳澄滨;
根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。
2012年04期 v.32;No.184 517-520页 [查看摘要][在线阅读][下载 229K] [下载次数：317 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：40 ] |[阅读次数：1 ] - 孙翠平;赵金花;毕妍丽;赵蕾;苗立中;宋峰;沈志强;
对1例疑似鸭肝炎病毒和多杀性巴氏杆菌混合感染的10日龄肉鸭采用常规的病毒、细菌鉴定方法和RT-PCR、PCR方法分别进行病毒、细菌的分离与鉴定。病毒鉴定为新型鸭肝炎病毒,细菌鉴定为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌多杀亚种。细菌对SPF鸡的毒力试验结果显示,分离的巴氏杆菌与强毒标准株C48-1毒力相近,为强毒株。细菌对10日龄肉鸭的致病性回归试验结果表明,一定数量的该株巴氏杆菌可导致10日龄雏鸭的感染死亡。结果表明,该批肉鸭为新型鸭肝炎病毒和A型多杀性巴氏杆菌混合感染。这是国内首例从感染鸭肝炎病毒10日龄雏鸭肝脏中分离到多杀性巴氏杆菌。
2012年04期 v.32;No.184 521-524页 [查看摘要][在线阅读][下载 138K] [下载次数：110 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：3 ] - 高绪慧;刁有祥;唐熠;于春梅;张大丙;岳澄滨;
利用RT-PCR方法扩增鸭黄病毒的NS3基因406bp的特异性片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备核酸探针。特异性试验结果表明,该探针仅与鸭黄病毒的核酸特异性杂交,而与鸭瘟病毒、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的核酸杂交均为阴性。敏感性试验表明,该探针对鸭黄病毒的RNA最低检出限量为100μg/L。对疑似黄病毒感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测,以卵泡膜的检出率最高。该研究为鸭黄病毒感染的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。
2012年04期 v.32;No.184 525-528页 [查看摘要][在线阅读][下载 212K] [下载次数：294 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：50 ] |[阅读次数：2 ] - 马丰英;姚睿玉;邹浩勇;刘新军;何启盖;
利用分子克隆、定点突变以及重组表达技术获得猪肺炎支原体的主要免疫原蛋白p36、p46、p65和p97R1-Nrdf。设立以重组蛋白p36、p46和p65为试验Ⅰ组,以p36、p46、p65和p97R1-Nrdf为试验Ⅱ组,猪支原体疫苗安百克(M+PAC)为试验Ⅲ组,PBS+佐剂为空白对照组来免疫BALB/c小鼠。检测小鼠血清、肺脏以及经蛋白刺激脾淋巴细胞的猪肺炎支原体抗体、IFN-γ和IL-4。结果显示,Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体水平极显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.01);Ⅱ组IFN-γ水平极显著高于Ⅲ组,而Ⅱ组与Ⅰ组、Ⅰ组与Ⅲ组的IFN-γ水平无显著差异(P<0.05);但Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的IL-4水平差异不显著(P<0.05),但都极显著高于对照组(P<0.01);肺的检测结果中猪肺炎支原体抗体、IFN-γ和IL-4水平呈现一致性,都为Ⅱ组>Ⅰ组>Ⅲ组>对照组;而经刺激脾淋巴细胞检测结果为Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体和IFN-γ水平最高,而IL-4水平为Ⅲ组最高。由此可见,Ⅱ组通过激活体液免疫和细胞免疫途径,产生的猪支原体肺炎抗体水平最高;Ⅰ组亦能通过这2种免疫途径达到与Ⅲ组同样的免疫效果。
2012年04期 v.32;No.184 529-533页 [查看摘要][在线阅读][下载 203K] [下载次数：499 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：1 ] - 许信刚;杨丽花;童德文;
根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。
2012年04期 v.32;No.184 534-538+547页 [查看摘要][在线阅读][下载 444K] [下载次数：665 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：1 ] - 尹荣兰;王浩然;张艳晶;杨正涛;刘辉;李琳;张乃生;
扩增了奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌ClfA基因,并将其克隆至真核表达载体pVAX1启动子下游,构建成真核表达质粒,通过体外细胞转染试验,运用IFA方法进行抗原性初步确认,所构建的重组DNA疫苗质粒能在真核细胞中表达并被金黄色葡萄球菌抗体特异性识别。为进一步评价侯选疫苗的免疫原性,进行了BALB/c小鼠免疫试验,分别检测免疫后的ELISA抗体水平、Th1/Th2类细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖试验。结果表明,构建的核酸疫苗pVAX1-ClfA免疫小鼠后,ELISA抗体水平提高,Th1/Th2类细胞因子含量提升,T细胞增殖能力增强。
2012年04期 v.32;No.184 539-542页 [查看摘要][在线阅读][下载 233K] [下载次数：240 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：22 ] |[阅读次数：1 ] - 张晓君;梁利国;阎斌伦;毕可然;秦国民;
基于副溶血弧菌toxR基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;在Tm为85℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体;所制作的标准曲线在2.7×108～2.7×102拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.998,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单,耗时短,是副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及食品中针对副溶血弧菌安全检测的有效手段。
2012年04期 v.32;No.184 543-547页 [查看摘要][在线阅读][下载 189K] [下载次数：232 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：1 ] - 张瑞华;李春红;薛拥志;金梅林;陈焕春;
根据H9N2亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物,从本室分离保存的H9N2亚型猪流感病毒中扩增出血凝素基因,并将其克隆进pMD18-T载体,限制性酶切及序列测定后,进一步将其信号肽缺失并亚克隆到pGEX-KG中,使其在E.coli BL21(DE3)中与GST融合表达。SDS-PAGE显示表达的融合蛋白的相对分子质量约为90 000。Western印迹表明表达的蛋白质具有免疫学活性。表达产物位于包涵体中,包涵体经变性、复性处理,利用复性产物作为抗原,经碳二亚胺(EDAC)将表达产物和羧基化的乳胶共价偶联,建立了H9亚型猪流感病毒抗体的乳胶凝集试验的检测方法,结果表明,应用HA重组蛋白作为诊断抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于H9亚型猪流感抗体水平监测、流行病学调查和现地疫病普查。
2012年04期 v.32;No.184 548-551页 [查看摘要][在线阅读][下载 200K] [下载次数：162 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ]
- 许玮;杨倩;
通过禽流感灭活抗原配合黏膜免疫佐剂鼻腔免疫乳鸽,研究鸽呼吸道各段抗体分泌细胞的分布和数量。结果显示,首免后第3、5周,应用CpG免疫后肺IgG分泌细胞面积显著高于对照组(P<0.05),首免后第5,7周,应用CpG免疫后肺IgA分泌细胞面积显著高于对照组(P<0.05);首免后第3、5、7周,应用灭活禽流感抗原免疫后,鸽呼吸道各部位IgG分泌细胞和IgA分泌细胞面积与对照组无显著差异;应用禽流感抗原配合CpG和胆酸钠免疫后鸽呼吸道各部位单位面积中IgA分泌细胞和IgG分泌细胞面积均显著或极显著高于对照组(P<0.01,P<0.05)。结果表明,灭活禽流感抗原配合黏膜免疫佐剂通过鼻腔免疫能够提高呼吸道中IgA分泌细胞和IgG分泌细胞的面积,增强局部呼吸道体液免疫应答水平。
2012年04期 v.32;No.184 552-555+569页 [查看摘要][在线阅读][下载 373K] [下载次数：139 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 杨猛;张金来;陈陆;
用Vero细胞对2010年河南省采集的猪舍蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙型脑炎病毒(JEV)进行分子生物学鉴定,并对其PrM基因进行克隆、测序及病毒进化分析。结果显示,从采集的蚊虫标本中分离到1株基因Ⅰ型JEV(HN10-1)和1株基因Ⅲ型JEV(HN10-2)。结果表明,河南省同时存在Ⅰ、Ⅲ2种基因型JEV的传播和流行。
2012年04期 v.32;No.184 556-559页 [查看摘要][在线阅读][下载 267K] [下载次数：104 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ] - 张三东;王晶钰;王利勤;杨幼聪;马超;陈婷;董睿;李成山;任娟娟;刘万华;
获得高纯度具有生物学活性的重组布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,并进行抗原性的分析。将用PCR扩增出的布鲁菌Omp10、Omp25基因片段分别克隆到原核表达载体pET-32α中,构建pET-32α-Omp10/Omp25原核表达质粒。将其转入大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中,用IPTG诱导表达,经HisTrap HP亲和层析柱分离纯化,分别用Western-blot和间接ELISA检测产物的抗原性。基因测序及酶切鉴定证明pET-32α-Omp10/Omp25原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明,Omp10、Omp25融合蛋白均以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达。经过包涵体的变性、复性及亲和层析纯化,成功获得了大小分别为34 000和44 000的融合蛋白,与预测的相对蛋白分子质量一致。Western和间接ELISA试验证明纯化的Omp10、Omp25融合蛋白能被免疫的牛布鲁菌阳性血清所识别。结果表明,成功获得了布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,且均具有一定的免疫原性,通过血清学反应证实,Omp10、Omp25蛋白为布鲁菌病临床诊断试剂盒的研制奠定了基础。
2012年04期 v.32;No.184 560-565页 [查看摘要][在线阅读][下载 458K] [下载次数：182 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：1 ] - 于汪洋;李凤霞;孙喆;袁宝;高妍;马腾壑;戴立胜;徐靖博;孙广杰;许橙;张嘉保;
利用miRNA靶基因预测数据库TargetScan,RNA22对bta-miR-26b的靶基因进行预测,并鉴定bta-miR-26b的靶基因。生物信息学分析结果显示,在EphA2基因3′非编码区域(3′-UTR)有bta-miR-26b的保守结合种子序列。扩增含有bta-miR-26b结合位点的靶基因的3′-UTR区,插入双荧光素酶报告载体pmirGLo Dual-LuciferasemiRNA Target Expression vector,与bta-miR-26bmimics共转染Hela细胞后检测荧光素酶的活性变化。通过荧光素酶活性检测证明在体外bta-miR-26b可以与EphA2基因结合,证明EphA2可能为bta-miR-26b的一个靶基因。
2012年04期 v.32;No.184 566-569页 [查看摘要][在线阅读][下载 145K] [下载次数：213 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ]
- 刘焕奇;邹明;张启迪;曲志娜;毕可东;
以0.1mL/kg.b.w.YFM复方麻醉剂对野猪进行颈部肌肉注射,观察麻醉效果,并利用PHILIPS MP30监护仪和DATEX循环监护仪动态监测麻醉前后血流动力学变化,同步采取血样,应用放免法和比色法测定同时相血液相关细胞因子、神经递质的变化。结果显示,野猪麻醉期间血浆ET水平下降,6-keto-PGF1α水平升高,血浆ET、6-keto-PGF1α的变化与血流动力学各项指标的变化呈现出显著或极显著相关性;血清NO和血浆TXB2水平基本无变化。结果表明,ET、PGI2两大内皮源性血管活性因子参与了野猪YFM合剂麻醉所致的血流动力学变化的调节。
2012年04期 v.32;No.184 570-572页 [查看摘要][在线阅读][下载 104K] [下载次数：83 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 金晶;许无恨;李明谦;张鹏;马强;房希碧;官员;张英;于浩;郝琳琳;刘松财;
本试验先后进行2轮载体构建及转染试验,对牛乳铁蛋白基因启动子元件调控效应进行了分析。首先进行第1轮载体构建及转染试验:采用PCR方法,利用4对引物从牛乳铁蛋白基因5′调控区-1 799向3′端依次缺失500bp进行调控序列扩增,将获得的扩增片段替换pEGFP-N1的CMV启动子,构建了4个重组载体,将重组载体转染牛乳腺上皮细胞(BMEC),经筛选获得稳定的单克隆细胞,测定并比较各组细胞的荧光强度。在以上试验基础上,为进一步精确确定牛乳铁蛋白基因启动子顺式调控元件序列,进行第2轮载体构建及转染试验,方法同第1轮。结果表明,牛乳铁蛋白基因上游调控序列-1 323～-1 372存在负调控元件,-1 372～-1 560存在正调控元件。
2012年04期 v.32;No.184 573-576+582页 [查看摘要][在线阅读][下载 411K] [下载次数：146 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 盛晟;周杰;张佳;邵康;吴小雪;李维新;殷宗俊;
脂联素(Adp)是主要由脂肪组织分泌的细胞因子,有重要的生理作用。本试验旨在研究重组脂联素(rAdp)对皖南花猪脂肪细胞脂联素及其受体2,AMP激活蛋白激酶(AMPK)、过氧化物增殖剂活化受体α(PPARα)mR-NA表达的影响。选择10d皖南花猪皮下脂肪组织分离前体脂肪细胞,增殖培养至80%融合后换分化培养基培养,细胞分化后用0、2和10mg/L rAdp分别处理12和48h。油红O染色法鉴定脂肪细胞,MTT方法检测细胞活力;酶法测定培养液中甘油释放量,荧光定量RT-PCR方法检测脂肪细胞脂联素(Adp)、脂联素受体1(AdpR1)、脂联素受体2(AdpR2)、PPARα和AMPK mRNA表达。结果显示,rAdp处理后,脂肪细胞活力总体有降低趋势,10mg/L处理48h达到显著水平(P<0.05);rAdp处理对甘油释放的抑制作用未达到差异水平。rAdp处理12h后,脂肪细胞AdpR1和AdpR2mRNA表达显著升高(P<0.01),但无剂量依赖性;rAdp处理48h后,脂肪细胞AdpmRNA表达显著下降(P<0.05)。rAdp处理12h后,脂肪细胞PPARαmRNA表达显著升高(P<0.01),且有剂量效应性;而AMP AMPK mRNA表达均无显著性变化。结果提示,重组脂联素处理猪原代脂肪细胞有降低细胞活力和抑制脂肪细胞甘油释放量的趋势,能显著上调AdpR1、AdpR2和PPARα基因的表达,从而刺激脂肪酸氧化和甘油三酯的水解作用。
2012年04期 v.32;No.184 577-582页 [查看摘要][在线阅读][下载 374K] [下载次数：109 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：1 ] - 邢艳苹;杨峰;王瑜;何伯萍;李林溪;朱僧;马丽敏;雷连成;
用组织块接种法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,进行形态学观察、生长曲线的绘制和核型分析等生物学性状的检测,并进行酪蛋白基因的RT-PCR鉴定。结果显示,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞生长旺盛,具有典型的上皮细胞形态特征;染色体数目为60;能够正常表达奶牛乳腺上皮细胞的2种特异性酪蛋白基因,即as1-酪蛋白基因和β-酪蛋白基因。表明成功获得了奶牛乳腺上皮细胞克隆。
2012年04期 v.32;No.184 583-585+597页 [查看摘要][在线阅读][下载 328K] [下载次数：180 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ] - 赵晓娥;马保华;谢莹;屈晓君;张拓;
用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后(30代),增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组(30代和50代)山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组(5代)细胞,但差异不显著(P>0.05)。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组(30代)细胞一直生长缓慢,差异显著(P<0.05)。未转染组(30代)山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组(30代)分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组(50代)山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组(30代)细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组(30代)分别为11.0%和12.7%,差异极显著(P<0.01)。hTERT蛋白在转染组(30代)山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。
2012年04期 v.32;No.184 586-591+605页 [查看摘要][在线阅读][下载 374K] [下载次数：128 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 刘颖;任文陟;李苏楠;李万宏;付守鹏;吴永魁;汪凯;胡仲明;
为了研究冷应激对机体的影响及过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)在冷应激中的作用,本试验选用30头军牧一号猪,并随机分成5组,包括常温对照组和4个冷应激组。常温组在(21±2)℃饲养,冷应激组的温度设置分别为:(-10±2)、(-5±2)、(0±2)、(5±2)℃。冷应激2h屠宰后分别采集猪腹腔脂肪、颈部皮下脂肪、胸部皮下脂肪、肝脏、心脏与肾脏组织样品提取总RNA与总蛋白。通过荧光定量PCR技术检测了PPARγ2mR-NA的表达量;通过Western blot检测PPARγ2蛋白表达量。结果显示,各温度组猪腹腔脂肪、颈部皮下脂肪、胸部皮下脂肪、肝脏、心脏PPARγ2mRNA及蛋白表达量总体上差异显著(P<0.01),肾脏PPARγ2mRNA表达量总体显著升高,但其蛋白表达量总体呈下降趋势。结果表明,PPARγ2对冷刺激非常敏感,它除了可以调节冷应激时的脂肪代谢平衡,还对心脏有较好的保护作用,但是对肾脏的作用有限。本试验显示了冷应激中PPARγ2在脂肪代谢与能量代谢中作用,为研究冷应激对机体的影响及畜禽品质的提高奠定了基础。
2012年04期 v.32;No.184 592-597页 [查看摘要][在线阅读][下载 159K] [下载次数：402 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：2 ]
- 刘晓静;尹逊河;王宪龙;郭丽红;
应用脑立体定位技术微量注射6-OHDA于兔右侧纹状体内。术后每周观察以阿扑吗啡(Apomorphin,APO)诱导的旋转行为,并于术后6周处死兔,以黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化染色,观察黑质多巴胺能神经元的形态、结构及数量变化。结果表明,部分兔在术后即出现行动迟缓、躬身、易激怒等异常行为。术后6周时,20只兔中有16只在阿扑吗啡诱导后30min内的平均旋转圈数大于7r/min,达到成功模型标准。模型成功率达到80%。TH免疫组化染色可见正常对照组、假手术组及模型组未损侧黑质内有胞浆浓染、突起明显的TH免疫反应阳性神经元分布,神经元数量较多,轴突长度较长,且3者差异不显著(P>0.05);而模型组损毁侧黑质内TH免疫反应阳性神经元与上述3者相比,数目明显减少(P<0.05),残存的细胞染色较浅,胞体轮廓和突起均不清晰,轴突长度明显变短(P<0.05)。结果提示,将6-OHDA注射于兔单侧纹状体是一种制备帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型的有效方法,此法操作简便,动物死亡率低,模型制作成功率高。
2012年04期 v.32;No.184 598-601+614页 [查看摘要][在线阅读][下载 236K] [下载次数：110 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 苏荣胜;闫文龙;潘家强;贾雪霞;李海琴;许冬蕾;唐兆新;
向即时分离的肉鸡肝细胞线粒体培养液内加入终浓度分别为10、30、50μmol/L的Cu2+和200μmol/L GSH+50μmol/L Cu2+,孵育20min后,观察培养液中不同铜浓度对线粒体H2O2生成速率和呼吸链复合物活性的影响。结果表明,30μmol/L和50μmol/L的Cu2+能引起线粒体H2O2生成速率和呼吸链复合物活性出现明显加快和降低(P<0.05或P<0.01),10μmol/L Cu2+组没有出现明显变化;谷胱甘肽可显著抑制50μmol/L Cu2+引起的变化(P<0.01),对线粒体具有保护作用。
2012年04期 v.32;No.184 602-605页 [查看摘要][在线阅读][下载 117K] [下载次数：127 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 吴帅成;申海清;付本懂;宋舟;张翠;秦倩倩;吕爽;毕文岩;伊鹏霏;贺常亮;张长帅;韦旭斌;
为考察蟾酥缓释注射液体外释药行为,并研究其耳根穴注射免疫佐剂作用。本试验采用紫外分光光度法测定蟾酥缓释注射液在无膜溶出模型中的体外释放度;ICR小鼠皮下注射卵清白蛋白(OVA),同时耳根穴注射蟾酥缓释注射液,二免2周后分离血清和脾细胞,ELISA法检测血清OVA特异性抗体IgG水平,MTT法检测脾淋巴细胞刺激指数。结果:药物体外释放行为遵循零级动力学方程,其累积药物释放百分率(Q)与时间(t)的回归方程为Q=3.989t+0.322(r=0.999);蟾酥缓释注射液和蟾酥注射液耳根穴注射后血清OVA特异性抗体IgG水平和淋巴细胞刺激指数均显著高于正常免疫组(P<0.05),其中蟾酥缓释注射液组优于蟾酥注射液组,并减少了注射次数。结论蟾酥缓释注射液具有缓释作用,可以通过穴位注射提高抗原免疫水平。
2012年04期 v.32;No.184 606-608+632页 [查看摘要][在线阅读][下载 127K] [下载次数：212 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：1 ] - 康磊;李文立;姜建阳;李方正;任慧英;
选用1日龄科宝-500肉鸡240只,随机分为6个处理,每处理4个重复,每重复10只,Ⅰ组饲喂玉米-豆粕型基础日粮,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组分别在基础日粮中添加0.4%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%的谷氨酰胺,试验时间15～42日龄,共28d。试验期间从每天09:00-17:00温度维持在(35±1)℃8h,17:00至次日09:00温度维持在(30±1)℃,鸡舍相对湿度控制在70%～80%。试验测定了热应激条件下21、28、35、42日龄肉鸡小肠黏膜分泌型免疫球蛋白含量A,血浆中血液内毒素含量和白介素-1、肿瘤细胞坏死因子含量。结果表明,日粮中添加谷氨酰胺显著提高了21、28、35、42日龄热应激肉鸡小肠黏膜分泌型免疫球蛋白含量(P<0.05),降低血浆中血液内毒素、白介素-1、肿瘤细胞坏死因子的含量(P<0.05)。因此,在基础日粮中添加一定水平的谷氨酰胺可改善热应激肉鸡的肠道免疫性能。
2012年04期 v.32;No.184 609-614页 [查看摘要][在线阅读][下载 146K] [下载次数：315 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：17 ] |[阅读次数：1 ] - 程玉芳;苗建民;高志花;白雪梅;王净;王贝贝;郑培培;
选用72只35周龄罗曼褐种公鸡,随机分为6组,每组12只,对照组饲喂基础日粮,分别在基础日粮中添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/kg铬量的酵母铬,作为试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组,在热应激条件下(日:最高温度37.5℃,最低温度28.0℃,平均温度31.7℃)饲养45d。结果显示,在热应激条件下,给种公鸡日粮中添加一定量的酵母铬不仅能有效降低热应激对种公鸡肾脏组织的损伤,而且可显著提高血清中GSH-Px、SOD和CAT活性,降低血清中MDA含量(P<0.05或P<0.01)。结果表明,夏季高温环境下,在种公鸡日粮中添加0.8～1.0mg/kg铬量的酵母铬可通过增强机体的抗氧化功能,抑制机体内自由基和脂质过氧化物的产生,保护机体组织细胞膜的完整,维持机体正常生理功能。
2012年04期 v.32;No.184 615-618页 [查看摘要][在线阅读][下载 306K] [下载次数：172 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：2 ] - 王希春;徐述亮;王勇;陈亮;殷超;冯士彬;吴金节;
选取88头7日龄"杜×长×大"三元杂交仔猪,按体质量和性别随机分成11组,每组8头。仔猪经皮下注射进行免疫,A组(对照组)注射生理盐水,大豆球蛋白(11S)B、C、D免疫组注射11S500μg/kg.w,21日龄时进行二免,23日龄C、D组分别肌肉注射11S2 500、5 000μg/kg.w;大豆球蛋白(11S)E、F组不免疫,23日龄肌肉注射11S2 500、5 000μg/kg.w。β-伴大豆球蛋白(7S)分组同11S。所有仔猪于23日龄断奶,在7、21、35日龄时空腹称重,计算平均日增重。试验结束时,每组选择5头仔猪进行屠宰,取十二指肠近端、空肠中段、回肠近段各2cm,用于测定消化酶活性和组胺水平。结果显示,与对照组相比,免疫500μg/kg.w 11S和7S可显著提高断奶仔猪平均体质量和平均日增重(P<0.05或P<0.01),直接致敏2 500、5 000μg/kg.w的11S和7S可显著降低断奶仔猪的平均体质量和平均日增重(P<0.05或P<0.01);11S可显著降低断奶仔猪十二指肠、回肠中胰淀粉酶、蛋白酶和十二指肠脂肪酶活性(P<0.05或P<0.01),降低十二指肠、回肠组胺水平(P<0.05或P<0.01);而7S显著降低断奶仔猪十二指肠、空肠胰淀粉酶、蛋白酶和十二指肠中脂肪酶活性(P<0.05或P<0.01),降低十二指肠、空肠组胺水平(P<0.05或P<0.01)。与免疫组相比,免疫后致敏5 000μg/kg.w的11S可显著降低断奶仔猪的平均体质量和平均日增重(P<0.05或P<0.01)、十二指肠、回肠中胰淀粉酶、蛋白酶、十二指肠脂肪酶活性(P<0.05或P<0.01)和十二指肠、回肠组胺水平(P<0.05或P<0.01);致敏2 500、5 000μg/kg.w的7S差异不显著(P>0.05)。对仔猪提前免疫大豆蛋白抗原,能显著提高断奶仔猪的生长性能和小肠中消化酶活性,降低组胺的释放,从而促进仔猪的生长,并且7S的免疫效果明显优于11S。
2012年04期 v.32;No.184 619-623+636页 [查看摘要][在线阅读][下载 145K] [下载次数：318 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：2 ]
- 吕文发;贺实伟;王军;杨连玉;
以夏洛莱杂交牛(夏杂牛)和利木赞杂交牛(利杂牛)为研究对象,旨在明确营养水平与不同杂交组合对肉牛半腱肌中肌生成抑制素(MSTN)基因表达量的影响及MSTN基因表达量与产肉率的关系。将夏杂牛和利杂牛随机分成3组,分别饲喂以高、中、低3种营养水平的日粮,饲喂10个月后,屠宰采样,利用实时定量荧光PCR技术测定半腱肌中MSTN基因相对表达量,并对半腱肌的产肉率与MSTN mRNA相对表达量作了相关分析。结果表明,低营养和中营养条件下,夏杂牛的半腱肌中MSTN表达量极显著高于利杂牛(P<0.01),而高营养条件下,两者差异不显著(P>0.05)。对于利杂牛,中营养组牛半腱肌中MSTN基因表达量极显著高于低营养组和高营养组(P<0.01),而低营养组和高营养组间差异不显著(P>0.05)。对于夏杂牛,低营养组MSTN基因的表达量显著高于中营养组和高营养组(P<0.01),而中营养组MSTN基因的表达量也显著高于高营养组(P<0.01),且高营养水平下的2种杂交组合牛半腱肌的产肉率都与MSTN mRNA表达量成强负相关。研究结果表明不同杂交组合和营养水平对牛MSTN基因在半腱肌中的表达均有显著影响,对于2个杂交组合,高营养水平下牛半腱肌MSTN基因的表达量均显著低于低营养水平下的各组试验牛,且高营养条件下,MSTN基因表达量和产肉率之间存在着强负相关。
2012年04期 v.32;No.184 624-627页 [查看摘要][在线阅读][下载 110K] [下载次数：255 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：18 ] |[阅读次数：3 ] - 盛鹏程;朱瑞良;苗向阳;
针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为:9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。
2012年04期 v.32;No.184 628-632页 [查看摘要][在线阅读][下载 295K] [下载次数：130 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：1 ] - 葛晨霞;王龙涛;曹颖楠;谷博;杨雨江;姜怀志;
以绵羊发情周期的子宫内膜为研究对象,采用免疫组化方法定量检测绵羊发情周期子宫内膜的微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)表达量。结果表明:MVD的标记物CD34和VEGF在绵羊发情周期的子宫内膜中呈现相同的表达特征,即表达位点均在子宫内膜上皮固有层及肌层;两者均在发情后0d开始表达,5d最高。5d开始到15d表达量缓慢下降。子宫内膜VEGF表达量和MVD相关系数r=0.669,P=0,表明子宫角中VEGF表达量和MVD显著正相关。
2012年04期 v.32;No.184 633-636页 [查看摘要][在线阅读][下载 413K] [下载次数：130 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 陈洋;王典;曹颖楠;姜怀志;
采用S-P免疫组织化学法通过CD34抗体标记血管内皮细胞,测定绵羊发情周期的0、5、9、12、15d的卵巢内原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、近成熟卵泡、卵巢间质微血管的分布,并分析微血管密度(MVD)的变化规律,探讨绵羊发情周期不同时期各级卵泡微血管生成状态及卵泡微血管生成与卵泡发育的关系。结果表明,绵羊的原始卵泡周围无独立血管网,而初级卵泡的卵泡膜附近开始出现微血管,其MVD值为3.60±0.89,次级卵泡周围微血管密度值显著增高(P<0.05),MVD值为6.80±0.84。大窦腔卵泡0、5、9、12、15dMVD分别为15.80±0.84、23.00±2.30、22.40±2.41、21.20±2.28、34.80±2.39。0～5dMVD值显著升高(P<0.05),而5、9、12dMVD值差异均不显著(P>0.05),12～15dMVD值又明显升高(P<0.05)。卵巢间质MVD值在各个发情周期各个时期差异均不显著(P>0.05)。说明绵羊在发情周期内卵泡的血管新生是从初级卵泡开始的,并且卵巢的血管新生主要发生在卵泡上,而卵巢间质无血管新生现象。
2012年04期 v.32;No.184 637-640页 [查看摘要][在线阅读][下载 839K] [下载次数：100 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ]