- 黄小波;钱洪喜;曹三杰;文心田;马小平;
用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoRⅠ/NotⅠ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定。鉴定的pPIC9K-ORF7经SacⅠ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut+。重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性。本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础。
2013年08期 v.33;No.200 1137-1141页 [查看摘要][在线阅读][下载 340K] [下载次数：161 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 曹素芳;王岩;
构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果。PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA。分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HPPRRSV河南分离株HN1N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体。将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒。将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞。将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果。结果显示,PCR扩增到的CMV-siRNA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb。经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA。经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siRNAN2抑制效果最好。这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路。
2013年08期 v.33;No.200 1142-1149+1153页 [查看摘要][在线阅读][下载 581K] [下载次数：117 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李淞;朱玲;周远成;吴云飞;陈蕾;徐志文;郭万柱;
根据GenBank中猪嵴病毒(porcine kobuvirus)3D-RNA聚合酶基因序列设计并合成了1对特异性引物,建立了一种猪嵴病毒RT-PCR检测方法。反应产物测序结果与GenBank中猪嵴病毒SH-W-CHN/2010/China株比较,基因序列同源性为93%。利用该方法对猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、链球菌、猪巴氏杆菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验表明,该方法最低能检测到的病毒核酸含量为1pg。利用所建立的RT-PCR方法检测采集自我国四川地区123份临床样品,结果阳性率为59.3%,表明猪嵴病毒在四川地区猪群中流行率较高。
2013年08期 v.33;No.200 1150-1153页 [查看摘要][在线阅读][下载 191K] [下载次数：145 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 李文良;毛立;张纹纹;王小敏;茅爱华;甘源;江杰元;
采用PCR方法扩增猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE检测目的蛋白得到成功表达,采用His标签单抗和PCV-2阳性猪血清进行Western blot鉴定表明重组蛋白具有良好的抗原性。利用纯化的重组蛋白rRep作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。抗原最适包被质量浓度为1mg/L(0.1μg/孔),待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶3 000。用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清,结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为<5%和<10%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用rRep-ELISA对113份血清样品进行检测,与rCap-ELISA结果比较,rRep-ELISA检测阳性率为50.44%(57/113),略低于后者的54.87%(62/113),2种方法检测符合率为88.5%(100/113),具有较好的一致性。这为PCV-2感染的流行病学调查和新型ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。
2013年08期 v.33;No.200 1154-1158页 [查看摘要][在线阅读][下载 185K] [下载次数：197 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 商雨;郭静;王红琳;罗青平;胡薛英;邵华斌;程国富;温国元;
经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对,在其F基因上找到1段相对保守序列,根据保守序列设计1对引物和1条TaqMan探针,以新城疫Ⅰ系疫苗株(Mukteswar株)作为标准品,通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法。该方法能检测最低初始病毒浓度为102.2 ELD50/mL,且在108.2~102.2 ELD50/mL内Ct值与病毒浓度的对数值(lgELD50/mL)呈很好的线性关系,R2达到0.997 5;该方法对禽流感、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应;批间和批内重复性良好;临床样品检测中荧光RT-PCR与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98.5%,50.0%和98.4%。因此,荧光RT-PCR检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法,为新城疫病毒的研究奠定了一定的基础。
2013年08期 v.33;No.200 1159-1162+1169页 [查看摘要][在线阅读][下载 227K] [下载次数：192 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 段旭基;张鹏;吴朋朋;马静;陈胜利;郝华芳;张定全;韩青松;付向晶;张渭东;杜恩岐;杨增岐;
为评价秦岭北麓关中地区野鸟源基因Ⅸ型新城疫病毒(NDV)流行及毒力情况,对374份源于该区域健康野鸟的咽喉、泄殖腔拭子进行病毒分离与鉴定,并对NDV分离株进行生物学特征和遗传进化分析。结果共分离到5株野鸟源NDV(包括2株候鸟源),其致病指数MDT、ICPI、IVPI差异较大,分别为37.2~64.8h,0.425~1.638,2.04~2.76。F基因(535bp)推导氨基酸序列和同源性分析显示,5株NDV分离毒均具有强毒的融合(F)蛋白裂解位点112R-R-Q-R-R-F117,5株分离毒间同源性高达99.8%~100.0%。F基因高变区(42~420nt,374bp)分析显示5株分离毒均属于我国特有的基因Ⅸ型NDV,与我国早期的基因Ⅸ型NDV流行株F48E9亲缘关系很近(核苷酸同源性为99.4%~99.6%),而与La Sota和V4等传统疫苗株及目前家禽中流行基因Ⅶ型NDV毒株亲缘关系较远。本研究表明,健康野鸟为基因ⅨNDV的携带者,尽管首次获得的5株野鸟源基因Ⅸ型NDV毒株生物学特征差异较大,但均具有强毒的分子生物学特征及致病性,提示对周边环境和家禽养殖业存在潜在威胁。
2013年08期 v.33;No.200 1163-1169页 [查看摘要][在线阅读][下载 360K] [下载次数：163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 金元昌;韦平;袁志栋;李玉峰;
建立基于SYBR GreenⅠ的real-time FQ-PCR方法检测并定量鸡外周血淋巴细胞(peripheral blood leukocytes,PBLs)中马立克病毒(Mareks disease virus,MDV)的载量(以meq基因为定量标准),并将此技术的敏感性与标准PCR方法进行对比。应用PCR技术从MDV-1攻毒后的霞烟鸡PBLs中扩增MDVmeq基因的部分片段,纯化上述基因的DNA扩增产物,然后克隆到pGM-T载体,重组质粒通过PCR和EcoRⅠ酶切及测序分析进行确认;将浓度梯度的meq基因的重组标准品质粒DNA进行real-time FQ-PCR,建立其相应的标准曲线。同样以质粒DNA为模板,real-time FQ-PCR方法的最低检出率为10拷贝,而标准PCR的最低检出率则为32拷贝。结果表明,在检测MDV时,real-time FQ-PCR敏感度比标准PCR要高。
2013年08期 v.33;No.200 1170-1173+1178页 [查看摘要][在线阅读][下载 315K] [下载次数：131 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 袁远华;王俊峰;吴志新;黄兴国;贺东生;黄淑坚;
从广东清远地区临床病变为发病鸭软脚,肝、脾肿大,有点/块状出血、坏死,其他各脏器不同程度出血的病死雏番鸭肝、脾组织中分离到1株病毒。通过形态观察、核酸图谱鉴定、RT-PCR扩增、基因序列分析、动物回归试验结果表明,该病毒为一株不同于以往番鸭呼肠孤病毒的新型鸭呼肠孤病毒,并命名为DRV-QY株。
2013年08期 v.33;No.200 1174-1178页 [查看摘要][在线阅读][下载 400K] [下载次数：356 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：22 ] |[阅读次数：0 ] - 国纪垒;刁有祥;程彦丽;宋晓娜;张坤;肖坡;杨建朋;孙晓艳;
将Ⅰ群禽腺病毒血清10型山东分离株(SDXT株)通过皮下注射接种途径人工感染1日龄SPF雏鸡,观察试验鸡的发病情况及临床症状;于感染后不同时间随机剖杀试验组和对照组鸡只,采集心脏、肝脏、肺脏和肠道等组织固定、切片、H.E.染色,观察各器官病理组织学变化,并进行血常规和血液生化指标检测。同时,应用IFA对SDXT株人工感染雏鸡的各组织器官进行检测。结果表明,SDXT株接种后,引起雏鸡精神沉郁、食欲不振、嗜睡等症状。病理组织学变化以肝脏脂肪变性、肝脏结构紊乱、肝窦间出血和炎性细胞浸润,在肝细胞核内可见嗜碱性包涵体为主;肠道内肠绒毛脱落;肺脏广泛性出血和炎性细胞浸润为特征。IFA检测结果显示,肝脏、脾脏、肠道、肺脏均可检测到SDXT株,其中肝脏和肠道检出率最高,表明这2个器官是其主要靶器官。HGB、WBC、RBC、ALT和ALP发生显著变化。结果表明,Ⅰ群禽腺病毒血清10型对雏鸡有较强的致病性。
2013年08期 v.33;No.200 1179-1183页 [查看摘要][在线阅读][下载 679K] [下载次数：345 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：19 ] |[阅读次数：0 ] - 谢丽基;谢芝勋;邓显文;谢志勤;庞耀珊;范晴;刘加波;
根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,对鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检测敏感性均达到200个模板拷贝数;该方法特异性强,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。本研究建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测。
2013年08期 v.33;No.200 1184-1189页 [查看摘要][在线阅读][下载 481K] [下载次数：176 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 林艳;赵扬;夏静;邹年丽;文心田;曹三杰;黄勇;
为分析髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒(ALV-J)地方分离毒株的分子特征及开展该病毒的反向遗传操作研究,本试验从四川某肉种鸡场髓细胞瘤病变病鸡的组织中分离到1株髓细胞瘤型ALV-J,命名为SCGS-1。序列测定表明其前病毒cDNA全序列长7 499bp,与其他ALV-J代表毒株序列相似性均为95%~99%。在所有基因中,其env基因和LTR序列与其他毒株相应序列同源性相对较低,env基因同源性为93.0%~99.5%,LTR基因同源性为92%~95%,pol基因同源性为97%~99%,gag基因同源性为94%~97%。根据该毒株序列和质粒pUC19的序列,将SCGS-1株前病毒cDNA全序列分3段克隆入pUC19中,构建含SCGS-1前病毒cDNA的重组载体并命名为pUC-SCGS。试验结果为研究ALV-J的进化规律和开展反向遗传操作打下基础。
2013年08期 v.33;No.200 1190-1195页 [查看摘要][在线阅读][下载 416K] [下载次数：133 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 陈轶霞;刘俊林;王明明;徐继英;骆学农;
结合文献报道并通过计算机软件分析筛选出羊痘病毒(SGPV)A4同源核蛋白和A27、A33、B5、L1同源膜蛋白基因的T、B细胞优势抗原表位共6段,采用人工合成的方法将各抗原表位以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头串联成一条全新的多表位嵌合基因E。将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pcDNA3.1-E质粒。用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;提取转染细胞总RNA,RT-PCR方法检测目的基因的转录。结果所构建的真核表达质粒在BHK-21细胞中能表达目的蛋白,RT-PCR方法检测到目的基因的转录;表明表达产物能与相应抗体特异性结合,具有一定的生物学活性和抗原性,有望成为抗SGPV的核酸疫苗。
2013年08期 v.33;No.200 1196-1200页 [查看摘要][在线阅读][下载 333K] [下载次数：172 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 郭玲;杨绍林;张志和;陈世界;阳爱国;李德生;王成东;刘丹;刘杰;潘海波;李乡城;舒蕾;颜其贵;
根据GenBank中登录的犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计合成1对特异性引物;以CPV疫苗株为模板,建立了一种快速检测CPV的PCR检测方法,并应用于CPV诊断。结果显示,以此对引物进行PCR扩增能得到与理论设计值大小一致的342bp的特异性条带,对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)扩增结果均为阴性;最低可检出约1.4pg的病毒核酸;重复性试验结果表明,其检测重复性好;对45份临床宠物犬病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测拭纸检测结果进行比较,吻合率为90.0%。将此方法初步应用于大熊猫粪便中细小病毒的检测,结果表明,从熊猫基地采集的52份正常大熊猫粪便样品中有8份为细小病毒阳性,阳性率为15.3%。大熊猫是通过自然感染还是弱毒苗感染细小病毒的机制还不清楚。
2013年08期 v.33;No.200 1201-1205页 [查看摘要][在线阅读][下载 261K] [下载次数：459 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：1 ] - 罗思思;谢芝勋;邓显文;谢丽基;谢志勤;庞耀珊;刘加波;范晴;
为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2条探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法。该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小。本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路。
2013年08期 v.33;No.200 1206-1211页 [查看摘要][在线阅读][下载 499K] [下载次数：264 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 陈学秋;马羽洁;周前进;张红丽;杨怡;闫宝龙;杜爱芳;
捻转血矛线虫感染性三期幼虫对干燥环境具有很强的抵抗力,环境适宜时可恢复到正常状态并继续感染宿主。为初步探讨捻转血矛线虫感染性三期幼虫抗干燥的分子机制,试验对该期幼虫施以不同干燥条件的处理,筛选出虫体存活率达到90%的干燥条件。在筛选到的条件下(相对湿度为50%,时间为60h)处理虫体,采用mRNA差异显示技术分析干燥环境下培养的虫体和正常虫体的mRNA表达差异。经验证获得了48个差异表达的EST序列,其中25个(52.08%)序列与现有捻转血矛线虫基因组数据库有高度同源性;15个(31.25%)序列与已知线虫的cDNA序列或基因组序列有较高同源性;9个(18.75%)序列与其他线虫已知蛋白质氨基酸序列同源性较高。差异表达序列AF-U01C与多种线虫的蛋白酶体β亚基家族成员同源性达90%,差异表达序列AG-U01A与多种线虫的β酮脂酰CoA硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)同源性达65%。结果为进一步研究寄生性线虫抗干燥机制奠定基础。
2013年08期 v.33;No.200 1212-1216页 [查看摘要][在线阅读][下载 330K] [下载次数：157 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 贾青辉;张艳英;史秋梅;房海;陈翠珍;张香斋;李佩国;
为了解禽致病性大肠杆菌分离株OMP、OmpT基因与血清型相关性,对6种血清型(O78、O38、O9、O91、O11、O157)的7株鸡源大肠杆菌菌株进行了外膜蛋白(OMP)和外膜蛋白酶T(OmpT)基因的研究。用N-十二烷酰肌氨酸法提取其外膜蛋白,经SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色,对鸡源大肠杆菌菌株进行了外膜蛋白分型;用PCR和生物信息学的方法对OmpT基因进行检测与分析。7株大肠杆菌共有3个OMP型,其中,分离株5,32,9主要由相对分子质量接近的2条带组成,为OMP-1型;分离株11主要由相对分子质量接近的3条带组成,为OMP-2型;分离株14,7主要由相对分子质量接近的1条带组成,为OMP-3型。这表明同一血清型的菌株可能属于不同的OMP型,而血清型不同的分离株之间却可具有相同的OMP型。PCR检测结果显示7株鸡源大肠杆菌均携带OmpT基因,与GenBank登录的序列比较发现其同源性为91.9%~100.0%,不同血清型菌株间的同源性为91.9%~98.0%。该试验证实了同一血清型分离株之间可发生遗传分化,而不同血清型分离株之间也可具有不同程度的遗传相关性;不同血清型分离株间的OmpT基因的同源性存在一定的差异。
2013年08期 v.33;No.200 1217-1222页 [查看摘要][在线阅读][下载 662K] [下载次数：170 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 曹德康;王雅静;万家余;李忠义;孟轲音;钱军;
为构建鼠类朊蛋白Shadoo基因重组真核表达质粒,并分析类朊蛋白Shadoo在鼠神经瘤细胞(Neuro-2α)内表达及定位。采用PCR方法把Flag标签序列插入到Shadoo阅读框122与123氨基酸位点之间,构建Shadoo-Flag融合基因片段,把Shadoo-Flag片段插入到真核表达质粒pcDNA3.1,构建重组真核表达pcDNA3.1-Shadoo-Flag,质粒酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转入Neuro-2α细胞,检测Shadoo基因表达及表达部位。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-Shadoo-Flag转入Neuro-2α细胞,能够正确表达出相对分子质量为12 000的Shadoo蛋白,并定位于细胞膜。
2013年08期 v.33;No.200 1223-1226页 [查看摘要][在线阅读][下载 160K] [下载次数：68 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 刘晔;袁颖烁;张守峰;张菲;张乐萃;扈荣良;
针对我国狂犬病临床诊断的现实需求,本研究根据狂犬病病毒基因组核苷酸保守序列,设计巢式引物,对引物工作浓度和退火温度进行了优化,并对RT-PCR敏感性、特异性和重复性进行了检验。结果显示,巢式RT-PCR方法最低能够检测0.01MILD50/30μL的脑组织病毒量,对阳性样品和非狂犬病感染样品的3次重复检测结果均与狂犬病诊断OIE推荐方法(荧光抗体染色法)的确定结果完全一致;在针对203份临床样品的检测中,FAT疑似样品通过MIT和巢式RT-PCR进一步确诊,巢式RT-PCR显示出较高的敏感性和特异性。以上表明,本研究建立的狂犬病病毒核酸巢式RT-PCR方法高度敏感和特异,可以用于FAT和MIT疑似样品的辅助检测,为试剂盒的研发与应用奠定基础。
2013年08期 v.33;No.200 1227-1231页 [查看摘要][在线阅读][下载 235K] [下载次数：120 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 林琳;江斌;吴胜会;张世忠;
旨在克隆猪丹毒杆菌表面保护性抗原A(surface protein A,SpaA)的编码基因,并预测该蛋白的二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨猪丹毒杆菌SpaA蛋白在免疫保护中所起的作用。首先对猪丹毒杆菌SpaA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并进行同源性比较。应用生物信息学方法,对猪丹毒杆菌SpaA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。结果显示,猪丹毒杆菌SpaA基因全长1 881bp,编码626个氨基酸,发育进化树结果表明分离的2株猪丹毒杆菌菌株与GenBank中其他菌株在进化树中关系较远,自成一个分支。二级结构的预测结果显示该蛋白主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主,只有少数的β转角;推测该蛋白有14个B细胞优势抗原表位区域、8个N-肉豆蔻酰化位点。该研究为进一步分析猪丹毒杆菌免疫机理、表位疫苗设计等奠定理论基础。
2013年08期 v.33;No.200 1232-1236页 [查看摘要][在线阅读][下载 180K] [下载次数：319 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 陶金忠;蒯淑霞;杨学文;武乾明;王剑锋;
采用商业化试剂盒Albumin&IgG Depletion Spintrap处理奶牛血清样品,比较处理前后对2-DE图谱的影响,结果发现处理后奶牛血清2-DE图谱中高丰度蛋白明显减少,但低丰度蛋白也有损失。采用不去除高丰度蛋白的方法比较健康奶牛与感染布鲁杆菌病奶牛的血清2-DE图谱,发现了11个明显差异的蛋白点,其中3个在正常奶牛血清中高表达,1个只在正常奶牛血清中表达;6个在患布鲁菌病奶牛血清中高表达,1个只在患布鲁菌病奶牛血清中表达。这些差异蛋白点的发现为将来质谱分析奠定基础。
2013年08期 v.33;No.200 1237-1240页 [查看摘要][在线阅读][下载 302K] [下载次数：76 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 韩东;冯新;韩文瑜;韩俊友;黄盼盼;何伯萍;许会会;雷连成;孙长江;
成功构建了能够高效表达鲎素TPⅠ基因的组成型毕赤酵母表达菌株,发酵培养后上清对分属于13个属的61株菌抑菌活性良好。应用肉汤微量稀释法测定发酵上清对金黄色葡萄球菌的抗菌活性,用扫描电镜观察其对金黄色葡萄球菌的抑制作用,并探讨发酵上清对小鼠皮肤感染模型的治疗作用。结果显示,基因工程鲎素对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)为(3.46±0.76)mg/L,亚抑菌浓度为(0.865±0.22)mg/L。基因工程鲎素对金黄色葡萄球菌小鼠感染模型的治疗效果与抗生素差异不显著(P>0.05),且具有刺激小鼠血管内皮生长因子表达水平增加,加速血管生成和血管发生,促进皮肤创伤愈合的功能;表明基因工程鲎素对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有良好的治疗效果。
2013年08期 v.33;No.200 1241-1246页 [查看摘要][在线阅读][下载 755K] [下载次数：300 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 任思宇;耿毅;汪开毓;周赵英;刘星星;吴春艳;
从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到1株链状革兰阳性球菌P110323,以1×106 CFU/mL菌液灌胃感染健康家兔后,表现出站立不稳、四肢划动、惊厥和呼吸障碍等症状,感染96h后,死亡率为60%。解剖见肺淤血、出血;肝、脾和肾肿大,坏死;大脑肿胀,脑膜充血,脑回肿胀扁平,脑沟变浅。分离菌在BHI平板上形成湿润、边缘整齐的灰白色菌落;在5%的脱纤维羊血平板上形成透明的β溶血环;V-P试验、水解精氨酸与马脲酸等为阳性;水解七叶苷和利用甘露醇、山梨醇和乳糖产酸为阴性。16SrDNA系统发育分析显示分离菌与Streptococcus difficilis和Streptococcus agalactiae聚在一簇。gyrB基因系统发育分析表明分离菌属于无乳链球菌(S.agalactiae),结合细菌形态特点和生理生化特性鉴定该病原菌为无乳链球菌(S.agalactiae),多重PCR方法确定该菌荚膜多糖类型为Ia型。
2013年08期 v.33;No.200 1247-1252页 [查看摘要][在线阅读][下载 528K] [下载次数：127 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 罗洪林;张文韬;郭智莉;周雪梅;周容琼;周作勇;
为弄清肝片吸虫感染早期的主要细胞免疫类型及选择性激活巨噬细胞(M2或AAMΦ)标记分子的变化,本试验采用肝片吸虫囊蚴为感染源,经口分别感染雌性BALB/c野生型小鼠,运用特异性PCR鉴定成功感染小鼠后用间接ELISA对腹腔中IL-4和IFN-!的水平进行测定,并对细胞因子IL-4、转录因子GATA3和M2的标记蛋白Relm"、Ym1分子的mRNA进行荧光定量PCR检测。结果显示,在感染后1,3,5,7周,从所获取肝脏组织中扩增的ITS2片段条带清晰,大小正确,测序后确定为肝片吸虫ITS2序列,表明肝片吸虫感染成功。对腹腔中IL-4和IFN-!的水平测定表明感染组IL-4在感染后1,3,5周比对照组的显著增加(P=0.013,P<0.01,P=0.02),但在第7周时无显著差异。IL-4的水平显著高于IFN-!(P=0.011),而在第7周两者间无显著差异;对腹腔中IL-4、GATA3、Relm"和Ym1mRNA水平的测定结果表明,感染后IL-4和GATA3mRNA水平在第3周达到最高峰;于感染后1,3,5,7周,IL-4和GATA3mRNA水平都分别显著高于对照组(IL4:P=0.01,P=0.012,P=0.023,P=0.014;GATA3:P=0.011,P<0.01,P=0.032,P=0.014),但IL-4和GATA3间无显著差异;Relm"和Ym1mRNA水平都分别显著高于对照组(Relm":P<0.01,P<0.01,P<0.01,P=0.011;Ym1:P<0.01,P<0.01,P<0.01,P=0.012),且二者间无显著差异,并随时间推移mRNA水平都呈下降趋势,于第7周达到最低水平。本研究成功利用肝片吸虫-小鼠模型研究蠕虫感染早期细胞免疫类型及M2标记分子的变化,发现在肝片吸虫感染小鼠早期主要引起Th2为主的细胞免疫。IL-4和M2巨噬细胞标记分子Relm"和Ym1在感染后1,3,5,7周都显著增加且具有相似的变化趋势,但Relm"和Ym1在第1周的高表达可能受诸多因素的影响还有待深入研究。
2013年08期 v.33;No.200 1253-1258页 [查看摘要][在线阅读][下载 316K] [下载次数：178 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]
- 王帅;陈根元;张玲;吴书奇;马春晖;
为了探讨苦马豆素对家兔脑组织抗氧化功能的影响,进一步揭示苦马豆素的毒性作用机理。24只家兔随机分为4组,即对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组。将小花棘豆全草粉碎后,按Ⅰ组添加15%(含苦马豆素30mg/kg)、Ⅱ组添加30%(含苦马豆素60mg/kg)、Ⅲ组添加45%(含苦马豆素90mg/kg)的比例制作混合饲料,饲喂至出现中毒典型临床症状为止。攻毒后14,35,70d每组随机采集2只家兔的肝脏组织,检测SOD、GSH-Px、CAT、NOS活性及MDA、NEFA、·OH、LPO、NO和Glu含量的变化。结果显示,与正常对照组相比,试验组家兔肝脏SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化物酶的活性极显著下降(P<0.01),而MDA、NEFA、·OH、LPO、NO和Glu含量极显著上升(P<0.01)。结果表明,不同浓度苦马豆素对家兔脑组织抗氧化功能有显著影响,且具有一定的时间效应和剂量效应关系,长期低剂量摄入苦马豆素可引起家兔不同程度的脑组织损伤。
2013年08期 v.33;No.200 1272-1277页 [查看摘要][在线阅读][下载 578K] [下载次数：127 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 周宏超;郭良;史嘉瑜;赵煜;刘晓强;杨鸣琦;李引乾;
10周龄SD大鼠单剂量腹腔注射5mg/kg玉米赤霉烯酮(ZEA)玉米油溶液,分别于攻毒后3,6,12,24,48,72,96h剖杀取卵巢组织,检测不同时间卵巢组织中p53和NF-κB的表达。病理组织学观察发现卵巢组织出现不同程度损伤,卵泡颗粒细胞凋亡。免疫组化结果表明试验组与对照组卵巢组织中均有p53和NF-κB的表达,并且随着时间的推进呈现动态变化。试验组p53在3,6,12h时表达量上调,12h后表达量逐渐下降,各试验组与对照组相比较均差异显著(P<0.05)。NF-κB在3h表达量最高,而后表达量开始降低,各试验组与对照组相比较差异均显著(P<0.05)。大鼠玉米赤霉烯酮中毒可引起卵巢组织的病变及颗粒细胞凋亡,且p53和NF-κB在玉米赤霉烯酮中毒大鼠卵巢颗粒细胞凋亡发生过程中起着一定作用。
2013年08期 v.33;No.200 1278-1281页 [查看摘要][在线阅读][下载 967K] [下载次数：112 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 郭志廷;梁剑平;韦旭斌;尚若锋;郭文柱;王学红;郝宝成;
为探讨常山提取物对鸡球虫病的治疗效果,通过人工感染15日龄鸡柔嫩艾美耳球虫后在饲料中添加一定比例的药物,试验设常山提取物组(分别为200,100,50mg/kg饲料)、鸡球虫散组(300mg/kg饲料)、地克珠利组(1mg/kg饲料)、感染对照组和健康对照组,试验期至22日龄。结果显示,与感染对照组比较,所有给药组试验鸡盲肠和十二指肠肿胀明显减轻,血液性内容物明显减少;抗球虫指数分别为171.98,169.18,169.01,163.84,166.74,均达到中等抗球虫水平。结果表明,常山提取物具有良好的抗球虫效果,且作为一类中药组分,具有绿色环保、低毒低残留的特点,有望成为新型抗球虫药物。
2013年08期 v.33;No.200 1282-1284+1287页 [查看摘要][在线阅读][下载 119K] [下载次数：280 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：22 ] |[阅读次数：0 ] - 刘海霞;刘俊栋;赵佳;邵春艳;刘宗平;李建基;
随着奶牛集约化饲养规模的扩大和产奶量的提高,奶牛真胃变位(DA)的发病率逐渐增加。研究表明,DA多发生在奶牛围产期,而围产期母牛体内雌二醇和孕酮含量改变明显。本试验进行了不同浓度的孕酮、雌二醇对离体真胃平滑肌收缩影响的研究,表明0.4~12.8μg/L的孕酮能使真胃平滑肌收缩强度显著降低(P<0.01),且呈剂量-效应关系。50.0ng/L~101.2μg/L的雌二醇能显著抑制真胃平滑肌的收缩强度(P<0.01),但不呈现剂量效应关系。
2013年08期 v.33;No.200 1285-1287页 [查看摘要][在线阅读][下载 166K] [下载次数：95 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 戴国俊;孙大辉;王翔;孙明明;王金玉;张跟喜;谢恺舟;施会强;侍苗苗;
以京海黄鸡为试验材料,采用PCR-SSCP技术检测斑联蛋白(zyxin)基因第7外显子SNP,探讨zyxin基因该位点多态性与京海黄鸡屠宰性能以及肉品质之间的关系。结果发现该位点存在1个SNP突变位点,表现为3种基因型,分别为AA、AB和BB。统计分析表明公鸡的肝质量、屠宰率,BB基因型显著高于AA型(P<0.05);腹脂质量、胸肌率、腿肌率,AA型显著高于BB型(P<0.05)。母鸡群体中,只有爪质量AA型显著高于BB型(P<0.05)。3种基因型对肉品质的影响均不显著(P>0.05)。
2013年08期 v.33;No.200 1288-1291+1300页 [查看摘要][在线阅读][下载 220K] [下载次数：126 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：0 ] - 官丽辉;刘海斌;张立永;刘立文;
900只1日龄塞北乌骨鸡采用5(能量)×2(蛋白)两因素配方设计,试验期6周。结果:6周龄母鸡日粮代谢能(ME)为12.65MJ/kg,体增重最高;公鸡日粮ME为12.00 MJ/kg,体增重最高。不同能量、蛋白水平日粮对21和42日龄塞北乌骨鸡血液生化指标存在不同程度的影响,高能量日粮可显著提高血清中血糖、总胆固醇和甘油三酯的含量(P<0.05)。在ME为12.65MJ/kg、蛋白为20%的日粮,3周龄母鸡的净体质量和肝质量极显著大于公鸡(P<0.01),消化道质量公鸡极显著大于母鸡(P<0.01)。在ME为12.65MJ/kg、蛋白为18%的日粮母鸡的净体质量极显著小于公鸡(P<0.01);心质量显著小于公鸡(P<0.05);消化道质量公鸡极显著大于母鸡(P<0.01)。0~6周龄消化道发育公鸡显著快于母鸡,但消化道总长变化不明显(P>0.05)。消化道总长与消化道各段长度的回归方程的决定系数(R2)均超过了0.807,总体效果公鸡略优于母鸡。21日龄时随着日粮能量水平的提高肠道胰蛋白酶活性除ME为10.85MJ/kg与12.00MJ/kg组差异显著外(P<0.05),公鸡其他各组间差异均不显著;母鸡在ME为12.65MJ/kg时最高。淀粉酶和胰脂肪酶不同能量间差异均不显著(P>0.05)。42日龄公鸡脂肪酶活性和胰蛋白酶活性都不显著(P>0.05);母鸡从总体来看,肠道消化酶活性随着日粮能量水平的提高而增加,日粮ME为12.65MJ/kg达到最高。
2013年08期 v.33;No.200 1292-1300页 [查看摘要][在线阅读][下载 200K] [下载次数：639 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：35 ] |[阅读次数：0 ] - 田明明;孙洪亮;王萍;何金娜;李润;李胜;李湘萍;石德顺;
为研究卵母细胞成熟过程中组蛋白H3第10位丝氨酸(H3Ser10)磷酸化变化规律及其表达水平,本研究以体外成熟兔卵母细胞为材料,采用免疫荧光标记方法检测兔卵母细胞成熟各时期组蛋白H3Ser10磷酸化的动态分布,同时探讨不同浓度组蛋白磷酸化激酶抑制剂(ZM447439)处理卵母细胞对组蛋白H3Ser10磷酸化表达的影响。结果显示:(1)兔卵母细胞组蛋白H3Ser10磷酸化始于生发泡破裂期(GVBD),且表达水平最高;第1次减数分裂中期(MⅠ期)磷酸化水平降低,第1次减数分裂后期(AⅠ期)及第2次减数分裂中期(MⅡ期)磷酸化水平呈上升趋势,但均比GVBD期低。(2)低浓度ZM447439对兔卵母细胞核成熟进程影响不大,当其浓度增加到30μmol/L时,93.5%的卵母细胞停留在GVBD期。(3)ZM447439浓度为5μmol/L时,20.7%卵母细胞H3Ser10去磷酸化,其他卵母细胞H3Ser10磷酸化信号与未处理组相似;当ZM447439浓度增加到30μmol/L时,大多数卵母细胞中的H3Ser10磷酸化消失。以上结果表明:兔卵母细胞组蛋白H3Ser10磷酸化始于GVBD期,且一直持续到MⅡ期,GVBD期磷酸化水平最高。ZM447439可有效抑制兔卵母细胞减数分裂的恢复,且随其浓度的增加,组蛋白H3Ser10磷酸化水平降低;当浓度达30μmol/L时,卵母细胞组蛋白H3Ser10终止磷酸化。
2013年08期 v.33;No.200 1301-1305页 [查看摘要][在线阅读][下载 223K] [下载次数：146 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张会娜;刘庆友;朱鹏;刘帅;杨素芳;石德顺;崔奎青;
为探讨水牛OCT4基因的表达调控模式,本研究扩增克隆了水牛OCT4基因5′调控序列片段,并设计了-2 571bp、-2 389bp、-2 338bp和-2 191bp 4个不同长度的调控序列片段,分别构建了EGFP表达报告载体。通过生产转基因猪早期胚胎和转染水牛胎儿成纤维细胞分析了不同长度调控序列片段的转录活性。结果发现,在猪4.5d胚胎中各调控序列均能成功启动下游EGFP表达,但转染水牛胎儿成纤维细胞48h后均未观察到荧光。QRT-PCR分析显示,-2 571bp片段在4.5d猪胚胎细胞中的转录活性极显著高于其他调控序列(P<0.01),-2 389bp与-2 338bp之间差异不显著(P>0.05),二者均极显著高于-2 191bp(P<0.01)。上述结果表明水牛源OCT4基因5′调控序列在猪早期胚胎中具有转录活性,且翻译起始位点上游2 191bp片段足以介导OCT4在多能性细胞中的特异性表达;-2 389~-2 338bp片段上游的CR4亦参与了猪4.5d胚胎中OCT4基因的转录调控。
2013年08期 v.33;No.200 1306-1312页 [查看摘要][在线阅读][下载 499K] [下载次数：98 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] 下载本期数据