- 贾川川;邢泽黎;郭昌明;朱利塞;余兴龙;王新平;
应用PCR技术从长春地区疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪检测到PCV2病毒基因组序列,并以PK15细胞分离获得1株病毒,命名为PCV2-CC12毒株。序列测定结果揭示:CC12毒株的完整基因组序列为1 767bp,含有2个较大的读码框架,编码病毒复制所需的Rep蛋白和病毒的结构蛋白Cap。核苷酸序列的比对分析发现,CC12株基因组的607位核苷酸存在一个独特的碱基突变(607A>G),导致其编码的Rep蛋白的186位氨基酸由天冬酰胺突变成丝氨酸(N186S)。应用PCR扩增病毒的全基因组序列并将其插入pBluescript II SK载体获得CC12株单拷贝基因组重组质粒,并以此构建了正向双拷贝重组质粒。重组质粒通过脂质体转染PK15细胞后,以RT-PCR、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)等方法检测拯救病毒,结果从盲传第8代后的细胞培养物中检测到病毒粒子的存在,表明CC12毒株拯救成功,为进一步研究PCV2病毒的复制机理及致病机理打下基础。
2014年12期 v.34;No.216 1861-1867页 [查看摘要][在线阅读][下载 499K] [下载次数：433 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 邓静;赵春容;曹三杰;文心田;黄小波;
为了掌握四川地区近年猪圆环病毒(PCV2)的分子流行和分子进化动态规律。将2010-2013年期间采集自四川成都、德阳、雅安、西昌、遂宁、乐山、资阳等11个养猪地区的疑似PCV2病料共324份进行了检测与分析。设计1对检测PCV2的特异性引物,PCR检测病料表明PCV2阳性为229份,PCV2感染率为70.7%。随后对本实验室分离到的11株PCV2分离毒株进行全基因组克隆与序列分析,11株PCV2四川分离株的全基因组序列分析均为PCV2b基因型,各地分离株之间的全基因同源性为95.2%~99.7%,与参考毒株之间的全基因同源性分别为94.1%~99.7%;与国内外参考毒株相比,ORF1的核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性分别为96.7%~100%、98.4%~100%,ORF2核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性88.0%~99.7%、85.4%~100%,序列分析发现ORF2变异位点较多,而ORF1相对较保守。本研究结果显示:2010-2013年间,四川地区PCV2感染率高,主要分布在乐山、德阳等市,且流行的基因型以PCV2b为主。
2014年12期 v.34;No.216 1868-1876页 [查看摘要][在线阅读][下载 2160K] [下载次数：281 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：24 ] |[阅读次数：0 ] - 付梦瑾;朱玲;周远成;杨文宇;李新琼;徐志文;
核转录因子κB是普遍存在于真核细胞中的转录调节因子,其信号通路在细菌、病毒感染宿主致病过程中起关键作用,直接调控宿主先天性免疫反应及细胞增殖、分化和凋亡,它的异常活化可能是PRV感染导致免疫抑制的重要原因。为进一步了解NF-κB C-Rel亚基序列特征及PRV对C-Rel mRNA转录时相的影响,本试验采用RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增NF-κB C-Rel ORF,获得阳性质粒后测序,进行相关生物信息学分析;运用实时荧光定量PCR技术对PRV感染PK-15细胞后不同时期C-Rel mRNA的转录水平进行定量分析。序列分析结果表明:所扩增猪C-Rel亚基ORF长1 773bp,编码590aa;猪C-Rel核苷酸序列与不同动物的C-Rel核苷酸序列相似性较高;大部分位于细胞核内(76.0%),无信号肽及跨膜区。荧光定量结果表明:与对照组相比,感染后0~4h,C-Rel转录水平下调,2和4h差异显著(P<0.05);4~12h,快速上调,12h达到转录高峰(P<0.01);12h后逐渐下降,24~120h,维持在较低水平,其中36h差异极显著(P<0.01),48、72和120h差异显著(P<0.05)。本研究推断PRV感染早期较弱的先天性免疫应答可能与C-Rel活化水平低下有关。
2014年12期 v.34;No.216 1877-1882页 [查看摘要][在线阅读][下载 264K] [下载次数：99 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 姜爽;阚式绂;胡宁宁;陈智飞;李一权;周晔;李霄;孙丽丽;金宁一;
通过敲除痘苗病毒天坛株(vaccinia virus tiantan strain,VTT)复制非必需基因TA35R,结合双筛选标记及同源重组技术,构建TA35R基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TA35R-。人工合成含有TA35R重组臂、同向loxp序列、早晚期启动子PE/L、EGFP及酶切位点的穿梭质粒pTA35R-EGFP。pTA35R-EGFP和野生型VTT共转染BHK-21细胞,通过绿色荧光蚀斑筛选,构建缺失TA35R基因且含FGFP基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R--EGFP+。采用Cre/Loxp系统敲除外源筛选标记EGFP,获得缺失TA35R基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R-,利用PCR方法和电子显微镜对其进行鉴定,通过MTT法检测细胞噬性以评价其减毒效果。结果表明,所构建的痘苗病毒弱毒株rVTT-TA35R-完全缺失了TA35R基因和外源筛选标记EGFP,且细胞毒性减弱。
2014年12期 v.34;No.216 1883-1887页 [查看摘要][在线阅读][下载 410K] [下载次数：109 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 董昌海;李红芳;刘元杰;王丹;高云欢;李丽敏;王家鑫;
为研究A型清道夫受体(SR-A)在重组口蹄疫病毒(FMDV)VP1-VP4蛋白诱导小鼠产生抗免疫应答中的作用,通过构建Pet32a-VP1-VP4原核表达系统制备VP1-VP4蛋白,用纯化的VP1-VP4蛋白分别免疫预先注射SR-A抑制剂的BALB/c小鼠和未作处理的BALB/c小鼠,用ELISA检测免疫7d后小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量,用琼脂扩散法测血清的抗体效价,用ELISA检测血清抗体亚类的含量。结果发现,经SR-A抑制剂处理的小鼠血清IFN-γ含量和IL-4含量均降低,血清总抗体效价也降低,但血清IgA水平显著升高,这表明SR-A在识别VP1-VP4蛋白进而启动免疫应答的过程中发挥广泛的调节作用。
2014年12期 v.34;No.216 1888-1892页 [查看摘要][在线阅读][下载 297K] [下载次数：111 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 邵西群;章秀婷;岳志刚;荣敏;闫喜军;杨福合;
为了确定鉴定阿留申病的适宜方法,尤其在阿留申病毒高感染貂场,本试验联合应用对流免疫电泳(CIEP)和PCR方法,对1个貂场连续2年于11~12月间检测1次貂血液的阿留申病毒及其抗体。用CIEP检测产仔(断乳成活数≥5只/窝)母貂及其仔貂。通过比较貂群的检测结果来分析2种检测方法鉴别阿留申病貂的适用性。2次检测结果显示各貂群CIEP阳性率为60%~97%,PCR阳性率为20%~63%,水貂的CIEP与PCR检测阳性结果不完全匹配。根据CIEP和PCR联合检测结果,貂群被分为4个群体CIEP+PCR+、CIEP-PCR-、CIEP-PCR+和CIEP+PCR-。2次检测的CIEP+PCR-貂在当年母貂中分别占48%、39%,在老母貂中分别占43%、77%,在公貂中分别占21%、51%。2次检测的CIEP+PCR-貂在貂群所占比例大,而CIEP-PCR-和CIEP-PCR+貂在貂群中所占比例小。公貂、老母貂经PCR阳性淘汰间隔1年再次检测,CIEP+PCR-貂在群体中比例明显提高。产仔2~4年龄母貂有72%~80%CIEP+貂,而其60日龄仔貂仅有11%~16%CIEP+貂。结果分析指出,中国阿留申病病毒高感染率养殖貂群不适宜单纯采用CIEP检测淘汰阳性貂净化阿留申病。发现每年11至12月用CIEP和PCR联合检测貂血样,易检出CIEP+PCR-的潜在阿留申病毒感染康复貂。
2014年12期 v.34;No.216 1893-1898+1905页 [查看摘要][在线阅读][下载 411K] [下载次数：287 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：21 ] |[阅读次数：0 ] - 穆昱;操时伟;周玉龙;李芹;丁壮;
为了制备针对鹿源BVDV E2蛋白的单克隆抗体,本试验通过RT-PCR技术扩增出鹿源BVDV E2的全长基因,并将其插入杆状病毒bac to bac表达系统的供体质粒pFast BacHTA中,构建含有BVDV E2基因的重组供体质粒pFast-E2,转化至含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac E.coli感受态中,经半乳糖苷酶的蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-E2,然后将其转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-E2,E2基因会随着杆状病毒的增殖而获得表达。表达产物经直接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-Blot定性分析,在大约38 000处出现1条特异性的蛋白印迹与预期大小相符,表明BVDV E2基因在该系统中得到了表达。本研究为研制针对鹿源BVDV E2蛋白的单克隆抗体及胶体金试纸条奠定了基础。
2014年12期 v.34;No.216 1899-1905页 [查看摘要][在线阅读][下载 447K] [下载次数：300 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 吴锦艳;田宏;陈妍;尚佑军;宋江伟;刘湘涛;
P32蛋白是羊痘病毒株中特异性很强的免疫原性结构蛋白,本研究利用原核表达系统对山羊痘病毒P32基因进行表达,并应用该蛋白建立了检测山羊痘病毒血清抗体检测方法。将P32基因克隆至pGEX-6P-1表达载体,经抗性筛选,测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了羊痘病毒重组pGEX-P32表达载体。经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达P32融合蛋白。融合蛋白纯化后SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,相对分子质量约56 000,表达产量约占菌体总蛋白的28%。Western-blotting检测表明,表达的融合蛋白能与羊痘阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物具有良好的反应原性。用表达的融合蛋白建立了检测羊痘血清抗体的ELISA方法,经方阵滴定,确定抗原最佳包被质量浓度为每孔0.4mg/L,最佳血清稀释度为1∶20。符合率试验表明ELISA方法和琼脂扩散试验的阳性符合率为83.44%,并且所建立的方法具有很好的特异性、重复性和敏感性,这为应用该融合蛋白制备山羊痘病毒免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。
2014年12期 v.34;No.216 1906-1911页 [查看摘要][在线阅读][下载 267K] [下载次数：185 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 金元昌;李玉峰;袁志栋;
为了建立鸡主要组织相容性复合体Ⅱ类(major histocompatibility complex class II,MHC II)基因实时荧光定量PCR(real-time FQ-PCR)的检测方法。本研究应用RT-PCR方法扩增鸡外周血淋巴白细胞(peripheral blood leukocytes,PBLs)的MHC II基因片断,将得到的目标片断克隆至pGM-T载体上,然后对重组质粒进行双酶切、PCR及测序鉴定;利用浓度梯度MHC II基因的重组标准品质粒DNA进行Real-time FQ-PCR,建立MHC II基因的标准曲线。经双酶切、PCR及测序分析显示,成功构建重组克隆质粒pGM-T-MHC II;对标准曲线进行分析表明,Ct值与其标准品浓度的对数值之间有良好的线性关系,为下一步应用Real-time FQ-PCR技术检测MHC II基因的转录水平奠定了基础。
2014年12期 v.34;No.216 1912-1915页 [查看摘要][在线阅读][下载 229K] [下载次数：145 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 邵红霞;吕亚楠;叶建强;金文杰;钱琨;秦爱建;
鹅细小病毒(GPV)主要引起雏鹅和雏番鸭的高死亡率。本研究对2013年采集的苏皖地区疑似GPV感染的病鹅组织,通过鹅胚病毒分离以及PCR扩增,共分离鉴定出11株GPV病毒。这11株GPV病毒的鹅胚致死时间为43~159h。与NCBI中检索到的21个VP3进行的序列分析发现,这些GPV的VP3氨基酸同源性为97.2%~100%。进化树分析表明,新分离的GPV VP3与分离于1982年的台湾GPV毒株82-0308最接近。与其他分离株VP3比较,这11株中有3株VP3中存在N35D、V261L、Y293H共突变现象。这些苏皖地区GPV毒株的分离、鉴定以及序列特征,对进一步探究苏皖地区GPV病毒的分子演化特征以及流行病学提供了材料。
2014年12期 v.34;No.216 1916-1921页 [查看摘要][在线阅读][下载 450K] [下载次数：164 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 聂奎;周作勇;曾兴艳;王裕文;
通过已建立的兔TLR-2、4mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法,对斯氏艾美尔球虫(E.stiedai)感染后的裂殖生殖期(感染后第8天)、排卵囊初期(感染后第15天)和排卵囊高峰期(感染后第21天),兔肝、脾和外周血单核细胞TLR-2、4mRNA表达水平进行检测。结果显示,TLR-2、4的RRT-PCR产物分别在82.3、79.0℃出现单特异峰,其相关系数分别为0.994 8、0.999 6,扩增效率分别为1.05、0.99。感染E.stiedai后,兔的肝、脾TLR2mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01),且在排卵囊初期最高;TLR4mRNA表达量在裂殖生殖期和排卵囊初期显著下调(P<0.01),而至排卵囊高峰期较对照组显著增加(P<0.01);3个阶段中兔外周血单核细胞TLR2和TLR4mRNA表达水平均显著低于对照组(P<0.01)。本研究提示TLR2和TLR4参与了兔体对E.stiedai的感染应答。
2014年12期 v.34;No.216 1922-1925页 [查看摘要][在线阅读][下载 212K] [下载次数：82 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 冯帅;汪莹;王彬婷;曾明华;李琳;
以秀丽隐杆线虫N2野生型为宿主,将鼠伤寒沙门菌ATCC13311定植于线虫体内,然后使用梯度浓度递增法提高培养液中的环丙沙星浓度,诱导沙门菌在线虫体内产生耐药性,同时进行体外诱导耐药试验。对体内、外诱导耐药菌的gyrA、gyrB、parC和parE基因的氟喹诺酮耐药决定区(Quinolone resistance determining regions,QRDR)和外排泵抑制子基因(acrR、marR、ramR和soxR)进行PCR扩增、测序和分析。结果表明,鼠伤寒沙门菌ATCC13311定植于线虫体内,经过诱导后得到环丙沙星MIC为4 mg/L的耐药菌TN4,体外诱导试验获得环丙沙星MIC为4μg/mL的耐药菌TW4。TN4的gyrA基因发生了Asp87Asn突变。体外诱导耐药菌TW4的gyrA基因发生了Ser83Phe和Asp87Val突变,ramR基因出现了20bp的缺失。本研究建立了鼠伤寒沙门菌-秀丽隐杆线虫体内耐药性诱导模型,并比较了体内、外诱导耐药菌的基因突变差异,为进一步研究细菌在动物体内的耐药机理奠定了基础。
2014年12期 v.34;No.216 1926-1930页 [查看摘要][在线阅读][下载 210K] [下载次数：304 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 李强;贾立军;郭焕平;李男礼;张守发;
为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。
2014年12期 v.34;No.216 1931-1934页 [查看摘要][在线阅读][下载 216K] [下载次数：120 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 石团员;鲍国连;索勋;付媛;舒琦艳;陈学智;
大型艾美耳球虫(Eimeria magna)是引起球虫病的主要兔球虫种类之一,药物防治依然是目前兔球虫病的主要控制手段,然而,耐药虫株的出现影响了抗球虫药物的防治效果,针对不同地理虫株筛选有效的药物或复方制剂是提高药物临床应用效果的重要途径。本研究以兔大型艾美耳球虫为模型,通过人工感染无球虫兔,来评价妥曲珠利及其复方制剂治疗兔球虫病的效果。试验结果显示,妥曲珠利-莫能菌素复方制剂(TOL-MS)的治疗效果最佳,在感染后第14天,TOL-MS治疗组兔平均低质量与不感染不用药组相当,为(825.60±33.61)g,显著高于妥曲珠利(TOL)、妥曲珠利-磺胺喹恶啉(TOL-SQ)和感染不用药组;并且,在感染E.magna后,除TOL-MS治疗组和不感染不用药组兔无临床症状外,其他各组兔均出现了不同程度的食欲不振、便秘和拉稀症状;而且,与感染不用药对照组相比,TOL-MS治疗组的E.magna卵囊减排率最高,为(99.22±0.09)%,高于TOL治疗组的(96.79±0.59)%,显著高于TOL-SQ治疗组的(9.51±5.87)%。该研究筛选到1种治疗兔球虫病效果显著的妥曲珠利复方口服溶液剂,将为兔球虫病防治提供有效的手段和科学依据。
2014年12期 v.34;No.216 1935-1939页 [查看摘要][在线阅读][下载 130K] [下载次数：218 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ] - 闫春梅;郑伟;张雅斌;李忠强;肖志国;于新海;
为防治水产养殖动物常见多发的小瓜虫病,本试验选取小瓜虫抑动蛋白基因,人工合成经物种优化后的抑动蛋白基因序列,以pVAX1为载体构建重组质粒,转入大肠杆菌DE3进行克隆表达。大量提取构建的重组质粒,通过肌肉注射免疫鱼体,注射剂量为125μg/尾,同时设立空载体对照组及空白对照组。首免后第4周进行二次加强免疫,分别于首免后第2、3、4周,二次加强免疫后第1、2、3、4、8、16周,抽样采集各组血液,分离血清,RT-PCR法检测抑动蛋白转录水平,同时检测血清抗体产生情况。二次加强免疫后第2周进行同居感染及人工感染试验,检测免疫保护效果。结果表明,质粒注射入鱼体后,所有抽查血液样本均检测到目的基因的转录;所有抽查免疫鱼血清样本均可以对小瓜虫幼虫产生制动效果,制动时间长达8周,空载体对照组和空白对照组无制动效果;同居感染及人工感染后,核酸疫苗免疫组存活率达到90%以上,而空载体组存活率为20%~40%,空白对照组全部死亡。表明构建的质粒作为核酸疫苗对小瓜虫病有较好的免疫保护效果,可显著降低死亡率。研究结果为小瓜虫核酸疫苗的研发与生产应用奠定了基础。
2014年12期 v.34;No.216 1940-1944页 [查看摘要][在线阅读][下载 226K] [下载次数：322 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ]
- 李和平;李曼曼;汪新建;王林枫;杨国宇;王月影;
为了阐明LPS诱导小鼠肝损伤过程中TLR4信号分子的变化,本试验以昆明小鼠为研究对象,经腹腔注射LPS,从形态学和肝功能指标变化判定肝损伤模型的建立,利用RT-PCR法检测各组肝脏组织中TLR4、IL-10、TNFα的转录水平。结果表明,随着LPS作用时间的延长,肝脏组织病理变化明显,肝窦不同程度充血,炎性细胞浸润,肝细胞呈现点状、小片状或多灶性坏死;血液和肝脏中GPT和GOT的活性升高,升高幅度依赖LPS作用时间,提示成功建立了肝损伤模型;RT-PCR结果显示,LPS诱导肝组织TLR4、IL-10、TNFα表达增加,且具有时间依赖性,TLR4、IL-10在3h表达开始升高,12h达高峰,TNFα变化幅度不如TLR4、IL-10变化显著,提示TLR4、IL-10、TNFα的表达水平依赖于肝损伤程度。
2014年12期 v.34;No.216 1962-1966页 [查看摘要][在线阅读][下载 346K] [下载次数：198 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 陈鹏举;郭炜彤;张昊龙;王汝都;赵庆枫;丁壮;
本试验初步探讨秦皮水提取物与抗菌药联合诱导含fosA3型耐药基因大肠杆菌传代的体外抑菌活性,为耐药大肠杆菌感染疾病提供治疗参考方案。采用二倍微量稀释法体外分别检测秦皮水提取物与抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),并以1/2 MIC的秦皮水提取物与抗菌药联合诱导含(fosfomycin resistance gene,FosA3)型大肠杆菌的传代试验。秦皮水提取物的MIC为1.0g/mL,以0.5g/mL的秦皮水提取物与头孢曲松钠、阿莫西林、诺氟沙星、粘杆菌素、痢菌净、磺胺间甲氧嘧啶、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻呋钠、氟苯尼考和磷霉素11种抗菌药联合诱导传代后MIC显著降低。结果显示:秦皮水提取物联合抗菌药诱导耐药细菌体外抗菌活性明显增强,对含fosA3型大肠杆菌具有耐药逆转作用。
2014年12期 v.34;No.216 1967-1970页 [查看摘要][在线阅读][下载 126K] [下载次数：182 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 薛文静;张昊龙;曾亚龙;刘红梅;谢珊珊;吕庆康;黄炳旭;付守鹏;王玮;柳巨雄;
分离培养wistar新生大鼠的下丘脑神经细胞,在培养第7天分别以不同浓度的β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA)(0、0.01、0.05、0.5、1、2mmol/L)和百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)(100μg/L)共处理24h,收集细胞,提取细胞总RNA,利用荧光定量RT-PCR方法检测促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)基因表达变化。结果显示,BHBA能显著抑制CRH基因的表达,且具有剂量依赖性,而PTX(GPR109A受体抑制剂)能阻断这种效应。BHBA可能作为信号分子与G蛋白偶联受体109A(GPR109A受体)结合,激活其下游信号通路,来调节下丘脑的分泌功能。
2014年12期 v.34;No.216 1971-1975页 [查看摘要][在线阅读][下载 280K] [下载次数：132 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 董海龙;吴庆侠;朱洪云;
为了检测转染人端粒酶逆转录酶催化亚单位(human telomerase reverse transcrip tase,hTERT)后建立的山羊永生化子宫内膜基质细胞(endometrium stromal cells,ESCs)是否存在潜在致瘤性。将hTERT导入2代山羊ESCs中建立永生化山羊ESCs(hTERT-ESCs),利用免疫细胞化学方法鉴定细胞并检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达;分别取2代山羊ESCs和55代hTERT-ESCs,使用含不同浓度血清的培养液培养,利用MTT法检测其血清依赖性;软琼脂克隆形成试验检测hTERT-ESCs在半固体培养基中的克隆形成能力,同时测定hTERT-ESCs的生长曲线。结果显示:转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈长梭形和三角形,与原代细胞形态一致,波形蛋白检测阳性,角蛋白检测阴性;免疫细胞化学方法显示hTERT阳性;hTERT-ESCs在含不同血清培养基中生长速度不同,具有血清依赖性;软琼脂克隆试验显示2代山羊ESCs和55代hTERT-ESCs均不能在软琼脂中生长;hTERTESCs具有正常体细胞生长曲线。证明hTERT-ESCs基本保持了正常山羊ESCs的生物学特性,不具有致瘤性。
2014年12期 v.34;No.216 1976-1981页 [查看摘要][在线阅读][下载 532K] [下载次数：190 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 李昊;薛超;张秋婷;王春生;朴善花;宋红卫;安铁洙;
为了获得绵羊MSTN基因敲低成纤维细胞株,克隆获得MSTN基因序列构建其真核表达载体;设计合成并筛选3种MSTN基因干涉序列(M1、M2和M3),构建相应的3种RNA干涉载体;将MSTN基因真核表达载体单独或分别与3种RNA干涉载体共转染绵羊成纤维细胞后,分别检测其对MSTN基因表达的干涉效率以获得最佳的MSTN基因RNA干涉载体;将筛选的RNA干涉载体线性化后转染绵羊成纤维细胞,通过筛选获得转基因细胞株。结果显示,成功克隆得到与GenBank中序列同源性为100%的绵羊MSTN基因序列,并获得真核表达载体pcDNA3.1(+)-MSTN;构建获得MSTN基因RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2和pRNAT-M3;与单独转染pcDNA3.1(+)-MSTN后293GP细胞中MSTN基因的相对表达量相比,转染干涉载体后MSTN基因相对表达量明显下降,其中pRNAT-M1干涉效率最佳;将pRNAT-M1线性化后转染绵羊成纤维细胞并利用G418筛选获得转基因阳性细胞;获得的转基因阳性细胞的细胞形态、生物学特性均呈现正常;PCR检测结果显示,pRNAT-M1已整合到细胞基因组中。上述结果表明,成功获得了MSTN基因敲低的绵羊成纤维细胞株。
2014年12期 v.34;No.216 1982-1988页 [查看摘要][在线阅读][下载 382K] [下载次数：103 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 田波;李栋;方梅;贾宁;
为了揭示成年牦牛大肠结构和黏膜免疫相关细胞的分布规律,本研究采用光镜及透射电镜等技术,对牦牛盲肠、结肠和直肠组织结构及黏膜免疫相关细胞的分布与数量变化进行研究。结果显示,牦牛大肠壁由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜构成。大肠黏膜上皮为单层柱状细胞及散在的杯状细胞,在直肠黏膜上皮中则有大量杯状细胞,黏膜上皮纹状缘不明显。固有层内含有大量肠腺和孤立淋巴小结,尤其在盲肠、结肠固有层孤立淋巴小结丰富,且生发中心明显,淋巴小结常伸入黏膜下层。大肠黏膜层平均厚度为(864.18±88.46)μm,其中结肠最厚,盲肠最薄,结肠与盲肠之间差异显著(P<0.01)。肌层分内环与外纵2层,结肠与直肠肌层发达,盲肠肌层最薄,盲肠肌层内环肌形成特殊的肌小结。上皮内淋巴细胞较多,以结肠最丰富,盲肠与结肠差异不明显,从结肠到直肠逐渐减少。盲肠有丰富的浆细胞,从盲肠、结肠至直肠依次减小。肥大细胞在结肠和盲肠均较多,在直肠则显著减少。超微结构显示,大肠黏膜上皮细胞之间有连接复合体,细胞游离面有许多排列整齐的微绒毛。上皮内淋巴细胞胞质少,胞核较大。肥大细胞胞质内有大小不等的高电子密度圆形颗粒聚集。研究表明,牦牛大肠组织结构和其他反刍动物基本相似,但肠壁肌层厚,盲肠有特殊的肌小结,盲肠和结肠黏膜层分布着丰富的孤立淋巴小结和黏膜免疫相关细胞。
2014年12期 v.34;No.216 1989-1994页 [查看摘要][在线阅读][下载 883K] [下载次数：194 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 祁宏伟;于维;吴伟;
选择1日龄AA肉仔鸡150羽,随机分为5个处理组,每个处理设3个重复,每个重复10羽。对照组饲喂基础日粮,4个处理组在基础日粮基础上分别添加250、500、750、1 000mg/kg的豆粕提取物,试验期49d。采用实时定量-PCR(RT-PCR)检测豆粕提取物对脾脏γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)的信使RNA(mRNA)的相对表达。结果显示,与对照组比较,500、750、1 000m/kg处理组的INF-γ和IL-2mRNA水平均显著增加(P<0.05);而1 000mg/kg处理组较750m/kg处理组INF-γ和IL-2mRNA表达量有下降趋势,但无显著差异(P>0.05)。结果表明,豆粕提取物能够诱导IFN-γ和IL-2 mRNA的表达,基础日粮中添加750 mg的豆粕提取物对IFN-γ和IL-2mRNA表达量作用效果最为明显。
2014年12期 v.34;No.216 1995-1999页 [查看摘要][在线阅读][下载 404K] [下载次数：109 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：1 ] - 黄海龙;陶淑霞;贾宇;孟祥明;钱爱东;
为探讨饲粮中添加抗菌肽高表达量黄粉虫对肉鸡免疫器官指数、抗体滴度、T淋巴细胞转化率的影响。本试验以玉米和豆粕为主要原料配制饲粮,采用单因子随机区组设计,选择1日龄雌雄各半、体质量相近、健康的爱拔益加(AA)肉鸡300只,测体质量后随机分为3个组,分别为对照组、黄粉虫未诱导组和黄粉虫诱导组,每组5个重复,每个重复20只鸡。对照组饲喂基础日粮,未诱导组和诱导组分别用未诱导和诱导的2%黄粉虫粉等量替代基础日粮中的鱼粉。试验期42d。结果显示,21日龄时,黄粉虫诱导组的脾脏指数显著高于对照组(P=0.042),黄粉虫诱导组的法氏囊指数较未诱导组和对照组分别提高11.62%和24.16%,但差异不显著(P=0.225),黄粉虫诱导组的胸腺指数极显著高于未诱导组和对照组(P=0.009),分别提高21.36%和39.92%。21日龄时,各组肉鸡的NDV抗体滴度均未表现出显著差异(P=0.282);42日龄时,黄粉虫诱导组的NDV抗体滴度显著高于未诱导组和对照组(P=0.014);黄粉虫诱导组外周血淋巴细胞转化率显著高于未诱导组和对照组(P=0.002)。可见饲粮中添加抗菌肽高表达量黄粉虫可促进肉鸡免疫器官的发育,提高肉鸡血液中抗体含量和淋巴细胞转化率,显著提高肉鸡免疫力。
2014年12期 v.34;No.216 2000-2004页 [查看摘要][在线阅读][下载 131K] [下载次数：239 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ]