- 张赫;南福龙;鲁会军;解长占;张萍;张金勇;庄忻雨;田明尧;步志高;金宁一;
应用反向遗传技术对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株感染性克隆PBRN-FL质粒进行操作,构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的重组质粒LaSota-ORF5并进行病毒拯救及鉴定。依据GenBank所发表的欧洲型PRRSV LV株ORF5序列,设计引物扩增ORF5片段,通过PBRN-FL质粒上P和M基因间的PmeⅠ酶切位点插入目的片段,构建重组质粒LaSota-ORF5。采用磷酸钙转染法将重组质粒和PCI-NP、PCI-P、PCI-L等3种辅助质粒共转染BSR-T7/5/细胞拯救病毒并对其分别进行RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和Western blot(WB)试验鉴定。结果显示:拯救病毒的RT-PCR产物测序结果正确,IFA出现绿色荧光,WB试验条带大小符合预期,证明GP5蛋白有效表达。结果表明:成功构建并拯救得到重组病毒rLaSota-GP5,为制备表达PRRSV GP5蛋白的重组NDV疫苗奠定基础。
2018年05期 v.38;No.257 841-845页 [查看摘要][在线阅读][下载 719K] [下载次数：268 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 赵紫印;李春燕;郭抗抗;张振仓;周宏超;张彦明;
从陕西省陕南、关中和陕北地区的规模化养猪场及屠宰场共采集猪血清696份,其中陕南262份、关中324份、陕北110份。分别采用RT-PCR和PCR方法检测血清样品中CSFV、PRRSV、PCV2、PRV的核酸;用ELISA方法检测血清中4种病毒的抗体。病原检测结果显示:所有样品中CSFV阳性率为14%、PRRSV为9%、PCV2为23%、PRV为20%,PCV2的感染率最高;陕南地区的样品中PRV检出率最高,为36%。陕北地区和关中地区的样品中PCV2检出率均最高,分别为40%和20%;来自散养户样品中PRRSV检出率最高,为74%。来自规模化猪场样品中PCV2检出率最高,为20%。抗体检测结果显示:所有样品中CSFV抗体阳性率为81%,PRRSV为70%,PCV2为83%,PRV-gI为16%,PRV-gB为38%,PCV2的抗体水平最高;陕南地区的样品中CSFV抗体阳性率最高,为87%。陕北地区和关中地区的样品中PCV2抗体阳性率均最高,分别为87%和82%;来自散养户和规模化猪场的样品中PCV2抗体阳性率均最高,分别为80%和85%。结果表明:这4种主要疫病在陕西省三大地区都普遍存在,本试验结果为养猪业防治猪病提供了参考资料,也为猪场的有效防控提供调查依据。
2018年05期 v.38;No.257 846-852页 [查看摘要][在线阅读][下载 546K] [下载次数：123 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：0 ] - 汪志;陈耀;孙彦阔;白小磊;冯松林;冯嘉萍;石庆伟;张桂红;
本试验对2011-2015年华南地区各规模化猪场进行了猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型等3种疾病的流行病学调查。利用RT-PCR方法分别华南地区猪场采集的3 529份组织样品进行病原检测,利用ELISA方法对93667份血清样品进行抗体检测。检测结果表明,2011-2015年,CSFV抗体阳性率则出现上升的趋势,由2011年的68.22%上升至2015年的85.47%,病原阳性率在2013年处于较低水平,在2014年和2015年呈现较大幅度增长,分别为30.41%和42.63%;PRV抗体阳性率均保持90%以上,PRV-gI病原检测阳性率在2014年和2015年呈下降趋势,分别为23.53%和13.25%;PCV2抗体阳性率趋于平稳。
2018年05期 v.38;No.257 853-856+882页 [查看摘要][在线阅读][下载 383K] [下载次数：218 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：16 ] |[阅读次数：1 ] - 时庆贺;石昂;李新果;王玉国;史志斌;张磊;陈陆;
采集了2016-2017年间不同地区临床疑似圆环病毒病病例样本65份,提取病毒核酸后,分别用PCV2和PCV3特异性引物进行PCR扩增,鉴定出PCV2阳性样品43份,阳性率为66.15%;PCV3阳性样品3份,阳性率为4.61%。选取其中13份PCV2阳性样品和3份PCV3阳性样品进行ORF2基因克隆、测序和进化分析。结果显示:河南省PCV2和PCV3流行毒株ORF2基因序列主要存在是单个碱基突变,没有缺失或插入。进化树分析显示,PCV2流行毒株均处于2b和2d2个基因群,其中7份属于2b型,6份属于2d型,2016年和2017年PCV2基因型并没有明显差别;3份PCV3阳性样品中KF-PCV3、AY-PCV3处于一个分支,SX-PCV3与MF589108形成一个分支。结果表明:2016-2017年间河南省感染和流行的PCV2主要为2b和2d2个基因群,表现出遗传进化稳定性,部分地区出现PCV3感染的情况。
2018年05期 v.38;No.257 857-862页 [查看摘要][在线阅读][下载 826K] [下载次数：192 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 张雪;谭强;赵文博;段旭阳;冯振月;马金柱;崔玉东;于永忠;
为了解羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)单克隆抗体2E4的抗体可变区的分子特征,选择其轻链和重链可变区基因分别进行体外扩增和测序,并通过IgBLAST程序分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/),确定了2E4抗体可变区的互补决定区(complementarity determining regions,CDRs)和骨架区(framework regions,FRs)氨基酸结构。继而,采用SWISS-MODEL同源建模方法,展示抗体分子轻、重链可变区的三维空间构型,并推测出可能的ORFV B细胞抗原表位多肽结合部位(pocket)。目的基因测序结果显示:2E4轻链可变区(VL)基因扩增全长为324bp,编码108个氨基酸;2E4重链可变区(VH)基因扩增全长为345bp,编码115个氨基酸。IgBLAST结果显示:轻链与GenBank公布的GHP53(GI:197494)单抗轻链可变区序列基因序列一致性达到97.6%;重链与VHSAF34(GI:215263227)单抗重链可变区基因序列一致性达到98.6%。并且,2E4轻链CDRs(CDR1-CDR3)分别位于25~34aa、52~54aa和91~98aa的序列位置;重链CDRs(CDR1-CDR3)分别位于25~32aa、50~57aa和96~104aa的序列位置。同源建模分析结果显示:这些CDRs区域共同形成的"pocket"极可能作为抗原表位多肽结合的位点。最终成功克隆2E4单抗可变区基因,分析了抗体轻、重链可变区CDRs构成形式,模拟了其空间构型,为进一步了解和验证"CDRs-表位"特异性结合的分子机制,并在Orf免疫保护中加以应用提供了可能。
2018年05期 v.38;No.257 863-870页 [查看摘要][在线阅读][下载 2499K] [下载次数：273 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 姜晓宁;田家军;杨晶;牛晓宇;王鸿志;高斌;唐熠;刁有祥;
2017年2-12月,我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群暴发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于5~20日龄的雏鹅,病鹅内脏器官及关节腔发生严重的尿酸盐沉积,死亡率最高可达50%,给养鹅业造成了巨大的经济损失。为确定引起该病的病原,本试验对在全国各地采集的143份样品进行了实验室检测及病原的分离鉴定。检测结果显示,禽星状病毒阳性检出率达96.5%(138/143)。对山东平原分离株(SDPY株)ORF1b基因进行了遗传进化分析,结果表明该分离株与已报道的鸡源、火鸡源、鸭源及鹅源星状病毒亲缘关系较远,核苷酸同源性仅为49.5%~67.7%。动物回归试验结果显示,1日龄健康雏鹅于接种SDPY株24h后陆续死亡,剖检表现为心脏、肝脏、肺脏、肾脏等内脏器官及关节腔的尿酸盐沉积与肾脏的出血肿大,与自然发病症状一致。由此确定,导致雏鹅痛风病的病原为新型鹅星状病毒。
2018年05期 v.38;No.257 871-877+894页 [查看摘要][在线阅读][下载 3527K] [下载次数：1710 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：118 ] |[阅读次数：1 ] - 刘新鑫;费亦东;陶志;李俊姣;陈严玉;杨莹莹;李青梅;丁壮;尹仁福;
对吉林地区送检的疑似禽腺病毒感染样品进行了分子流行病学调查,并对检测为阳性的样品进行病毒分离鉴定,共得到61个I型禽腺病毒流行毒株。对hexon基因进行的PCR扩增,获得长度为1 414,1 786,1 670bp的基因片段。通过测序分析发现,吉林地区禽腺病毒流行毒株基因型由B型变化为C型,血清型4型。根据同源性分析结果显示,本次获得的3个分离株与禽腺病毒4型标准毒株ON1株的核苷酸序列相似性较高,达到了99.1%。
2018年05期 v.38;No.257 878-882页 [查看摘要][在线阅读][下载 1753K] [下载次数：231 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 万文妍;刘延珂;王贝贝;吴艳阳;杨东东;高冬生;李永涛;王新卫;杨霞;常洪涛;陈陆;王川庆;赵军;
利用在大肠杆菌中表达的FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白作为包被抗原,建立了检测抗禽腺病毒血清4型(FAdV-4)中国流行株抗体的间接ELISA方法。所建立方法的最佳条件为:抗原最适包被量为0.25μg/孔,包被时间为37℃1h,然后4℃过夜;被检血清的最佳稀释度为1∶800,作用时间为2h;二抗选用HRP标记的兔抗鸡IgY,稀释度为1∶4 000,作用时间为1.5h;显色液TMB作用条件为室温5 min。所建立ELISA的判定标准为:样品的S/P值大于或等于0.055 3判为阳性,小于0.041 8判为阴性。用建立的ELISA方法对抗鸡新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法有较好的特异性,组内和组间重复的最大变异系数为5.6%和5.7%,所建立的ELISA方法重复性良好。用所建立的ELISA方法对50份来自于疑似患肝炎-心包积液综合征病鸡的血清样品进行检测,阳性检出率为98%,与FAdV-4病原学检测结果符合率为100%。结果表明:本试验所建立的ELISA方法可用于抗FAdV-4中国流行株抗体的检测,为肝炎-心包积液综合征病监测和流行病学调查提供了方法。
2018年05期 v.38;No.257 883-888页 [查看摘要][在线阅读][下载 305K] [下载次数：245 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ] - 赛福丁·阿不拉;阿依姑丽·买买提明;努尔艾力·麦提尼亚孜;阿得力江·吾斯曼;德力拜尔;
为研究一枝蒿的多糖、黄酮、多酚、生物碱、挥发油的抗鸡新城疫病毒的活性,多糖采用水煎醇沉法、黄酮采用浸提法、多酚采用超声法、生物碱采用超生辅助提取方法、挥发油采用水蒸气蒸馏法提取并测定含量。通过MTT法测定一枝蒿各成分对鸡成纤维细胞的安全浓度。在安全浓度以下5个浓度梯度范围内新城疫病毒(NDV)与药物以3种方式加到单层鸡成纤维细胞(CEF)上,即先加药后攻毒(阻断作用)、先攻毒后加药(抑制作用)、病毒和药物同时作用一段时间之后同时加入(直接杀灭作用),观察细胞的病变程度。细胞培养72h后用MTT法测定细胞D值的变化,用于评价药物对NDV感染细胞能力的影响。结果显示:多糖、多酚、黄酮、生物碱、挥发油均有一定程度的抗病毒活性,其中多糖对新城疫病毒的阻断作用及直接杀灭作用强于抑制作用。它们在抑制作用下的病毒抑制率分别为44.30%,11.00%,31.00%,12.94%和42.35%;直接杀灭作用下的病毒抑制率分别为27.27%,10.64%,22.85%,24.93%和10.38%;阻断作用下的病毒抑制率为33.33%,18.90%,35.19%,25.56%和40.74%。综上可知,多糖的抗鸡新城疫活性较好,其次是挥发油,可以作为进一步的研究材料。
2018年05期 v.38;No.257 889-894页 [查看摘要][在线阅读][下载 414K] [下载次数：155 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 常超越;张召兴;张志强;贾青辉;张建文;李蕴玉;吴同垒;李佩国;
安卡拉病毒属禽腺病毒C群Ⅳ血清型,临床上以引起患病鸡心包积液和肝炎为典型病理变化,发病急,死亡快,对养禽业造成巨大的经济损失。2016年5月秦皇岛市昌黎县某养鸡场养殖肉鸡大量死亡,死亡率高达80%,剖检见典型的心包积液、肝脏坏死和肾脏肿大,结合PCR鉴定、鸡胚和雏鸡接种试验,以及电镜观察,证明病原为安卡拉病毒,并命名为FAV-4QHD;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Penton、Fiber1和Fiber2基因测序和构建系统发育树发现,FAV-4QHD与近几年的国内分离株亲缘关系最近,与FAV-4标准株ON1和国外分离株差异较大。研究结果为进一步分析安卡拉病毒毒力增强机制奠定基础。
2018年05期 v.38;No.257 895-899+916页 [查看摘要][在线阅读][下载 1124K] [下载次数：279 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 彭志锋;张真真;卢彩景;陈陆;赵军;王川庆;王继洋;王坤芃;杨霞;
用PCR方法从鸭源鸡杆菌中国分离株PDS-RZ-1-SLG中扩增flfA基因,并运用生物信息学软件分析鸭源鸡杆菌菌毛蛋白FlfA的二级结构、表面可及性与B细胞优势表位簇;将目的基因插入原核表达载体Pet28a(+),经PCR、酶切及测序鉴定成功构建重组表达质粒pET28a(+)-FlfA,然后转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组质粒表达;SDS-PAGE和Western blot鉴定FlfA的表达及抗原性。结果显示:成功获得与预期大小一致的573bp的flfA基因;FlfA蛋白结构分析显示其二级结构以无规则卷曲为主,表面存在很多抗原表位;PCR及酶切等鉴定表明重组表达质粒pET28a(+)-FlfA构建成功。SDS-PAGE分析显示,经IPTG诱导表达获得相对分子质量约20 000的重组蛋白;Western blot分析结果显示重组菌毛蛋白能被兔抗rFlfA多抗血清和鸡抗鸭源鸡杆菌血清识别,抗原性良好;而且,rFlfA多抗血清与菌毛蛋白具有良好反应性。
2018年05期 v.38;No.257 900-905页 [查看摘要][在线阅读][下载 713K] [下载次数：130 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 姜延龙;王占楠;曾庆丰;王棋;姚心茹;王成宇;胡译文;杨桂连;王春凤;
利用PCR技术扩增FBA基因序列,并将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,获得pET-30a-FBA重组质粒。将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达His-FBA蛋白,通过His-tag Ni柱亲和层析纯化后,免疫新西兰大白兔制备FBA特异性多克隆抗体。再利用PCR技术将FBA基因与表达载体pYA3681连接,构建了表达载体pYA5129,电转至延迟裂解性沙门菌χ11802后以制备的FBA多抗为一抗进行免疫印迹试验,验证了其免疫原性;同时比较了不同浓度阿拉伯糖对重组沙门菌生长性能的影响,优化了阿拉伯糖最佳添加浓度,为后续研究其作为肉鸡坏死性肠炎疫苗的可行性奠定基础。
2018年05期 v.38;No.257 906-910页 [查看摘要][在线阅读][下载 580K] [下载次数：135 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 李蕴玉;张召兴;李佩国;张香斋;丁咚;贾青辉;张艳英;
为了确定柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株重组IL-2-EtMIC-2DNA疫苗的免疫原性与抗氧化能力,将240只14日龄雏鸡随机分成8组,每组30只,Ⅰ、Ⅱ组分别为阳性对照组和阴性对照组,Ⅲ、Ⅳ组在14、21日龄分别肌肉注射100μg的pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2,Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组在14、21日龄分别肌肉注射50,100,150μg的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2,Ⅷ组在21日龄免疫鸡球虫活疫苗;28日龄时,除Ⅱ组外,每只鸡接种4×10~4个E.tenella卵囊。结果显示:各免疫组鸡的外周血T淋巴细胞转化率、血清EtMIC-2抗体水平以及血清T-SOD、GSH-Px和TAOC活性较Ⅰ、Ⅱ组均呈现升高趋势,其中当pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重组质粒的免疫剂量达100μg/只时,使试验21d的外周血T淋巴细胞转化率、14,21,28d的血清EtMIC-2抗体水平和T-AOC活性,14,21d的血清GSH-Px活性以及14d的血清T-SOD活性均显著高于阴性对照组、阳性对照组、单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组(P<0.05)。结果表明:IL-2可增强EtMIC-2基因的免疫原性和抗氧化能力,适量的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重组质粒可显著提高机体的细胞与体液免疫水平以及抗氧化能力,达到抗球虫的效果。
2018年05期 v.38;No.257 911-916页 [查看摘要][在线阅读][下载 159K] [下载次数：110 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 何欣;刘军龙;刘爱红;王锦明;牛庆丽;李有全;殷宏;罗建勋;关贵全;
通过克隆trap基因,在原核表达系统中进行表达并纯化,Western blot鉴定TRAP蛋白反应原性,应用生物信息学分析软件分析验证该基因/蛋白的结构。以羊巴贝斯虫未定种新疆株gDNA和cDNA为模板扩增trap基因全长;并构建pET-30a-trap原核表达载体。将构建成功的表达载体转入BL21(DE3)pLysS进行诱导表达;纯化可溶性的rBspTRAP,Western blot分析其反应原性,并应用生物信息学分析软件分析验证该基因/蛋白的结构。结果显示:获得的trap基因全长为2 338bp,开放阅读框大小为1 944bp,具有5个内含子和6个外显子。氨基酸序列分析显示1~26位氨基酸为信号肽序列,45~201位和240~288位氨基酸分别为TRAP蛋白家族的vWA和TSP1结构域。Western blot结果显示羊巴贝斯虫未定种新疆/敦煌株阳性血清可特异性识别rBspTRAP,该重组蛋白与莫氏巴贝斯虫(临潭株、天祝株、河北株、宁县株)阳性血清及尤氏泰勒虫阳性血清无交叉反应。本试验成功克隆trap基因并表达,该基因可以作为免疫学诊断用候选抗原,为以后建立鉴别诊断莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫感染的免疫学诊断方法奠定基础。
2018年05期 v.38;No.257 917-923+936页 [查看摘要][在线阅读][下载 1644K] [下载次数：104 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ]
- 赵欣欣;姜禹;安星兰;翟岩辉;张胜;唐博;李子义;张学明;
结合红细胞裂解法和全骨髓细胞贴壁培养法分离获得胎牛骨髓MSCs(bBMSCs),经贴壁培养、传代纯化后对其生物学特性进行检测,进而设定不同浓度胎牛血清-血清替代物(FBS-KSR)组合培养基(10%FBS、5%FBS+5%KSR、2.5%FBS+7.5%KSR、10%KSR),对第5代bBMSCs进行体外培养,并对其增殖、多能性及凋亡情况进行检测。结果显示:原代bBMSCs具有贴壁特性,呈成纤维样细胞形态,表达MSCs相关标记分子CD73、CD90、CD105,不表达相关阴性分子标记CD45、CD34;体外具有成脂及成骨分化潜能,生长曲线呈典型的"S"型。CCK8检测显示,5%和7.5%的KSR可作为FBS的替代品,对bBMSCs体外增殖有显著促进作用。荧光定量PCR结果显示:添加不同浓度KSR后增殖相关基因bFGF mRNA水平显著升高(P<0.01),进一步证明KSR可以提高bBMSCs的增殖能力;多能性相关基因检测显示,添加KSR组中Oct4、Sox2mRNA表达水平也显著上调;凋亡相关基因检测显示,5%FBS+5%KSR组中抗凋亡基因Bcl2mRNA水平显著上调,而2.5%FBS+7.5%KSR组中Bcl2表达显著下降而促凋亡基因Bax mRNA水平显著提高。推测这是由于细胞传代培养1周时,各组中细胞可能处于生长周期的不同时期,5%FBS+5%KSR和2.5%FBS+7.5%KSR组中细胞已到达平台期,发生生长抑制,需及时传代,而10%FBS组中细胞仍处于对数生长期,未发生细胞凋亡。这也进一步说明,适当浓度KSR缩短了bBMSCs体外增殖周期,提高了细胞的增殖效率。结果表明:培养基中适当添加KSR有利于bBMSCs的体外扩增和多能性维持,同时需注意根据增殖周期变化调整传代时间,这对进一步优化牛及其他动物BMSCs的体外培养条件具有借鉴意义。
2018年05期 v.38;No.257 942-949页 [查看摘要][在线阅读][下载 1680K] [下载次数：147 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 张涵;邹辉;王云婷;韩涛;胡迪;卞建春;刘宗平;
为了探讨硫辛酸对镉致大鼠肝细胞缝隙链接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)损伤的影响及作用机制,本试验以大鼠肝细胞系BRL3A细胞为对象,以2.5μmol/L醋酸镉、50μmol/L硫辛酸、5μmol/L 18-β-甘草次酸处理细胞,Hoechst33258观察细胞核形态、细胞实时分析技术检测细胞指数,划痕染料标记示踪法(SL/DT)检测GJIC,免疫荧光技术观察缝隙连接蛋白Cx43分布,Western blot检测Cx43表达水平。结果显示:硫辛酸能有效缓解2.5μmol/L醋酸镉引起的BRL3A细胞形态学改变、细胞指数下降、GJIC抑制以及细胞膜上连接蛋白Cx43分布减少和表达水平下降。结果表明:硫辛酸对镉致大鼠肝细胞损伤有保护作用,其机制与GJIC有关。
2018年05期 v.38;No.257 950-955页 [查看摘要][在线阅读][下载 1867K] [下载次数：131 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 苏晶晶;李姿;兰云刚;吕晓玲;赵魁;刘丽颖;贺文琦;高丰;
首先利用荧光定量PCR和Western blot的方法分别从基因水平和蛋白表达水平检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomgelitis virus,PHEV)感染细胞对Beclin-1的影响,结果发现随着PHEV感染时间的增加Beclin-1表达呈现明显的上调趋势。其次,利用间接免疫荧光技术检测Beclin-1在PHEV感染后的N2a细胞中的定位变化,发现Beclin-1和PHEV呈现明显的共定位关系。随后构建Beclin-1的真核表达载体pCMV-FlagBeclin-1,将其转染至N2a细胞后接种PHEV,发现PHEV复制增殖特性并未受到显著影响。利用siRNA技术特异性敲低N2a细胞中的Beclin1水平,结果显示PHEV的表达量明显下调。本试验结果揭示了Beclin-1参与调控PHEV复制增殖的重要作用,为深入阐明PHEV致病机制提供了新的思路。
2018年05期 v.38;No.257 956-961页 [查看摘要][在线阅读][下载 1024K] [下载次数：128 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 杨慧君;王艺晖;李晓娜;陈程;吴帆;王桂琴;
采用PCR技术对231株牛源金黄色葡萄球菌进行7种毒力基因及2种大环内酯类耐药基因的检测,同时运用双纸片法即D试验对31株耐药表型为红霉素耐药而克林霉素敏感或中介菌株进行诱导耐药试验。结果显示:在231株金黄色葡萄球菌中,99.1%(229/231)的菌株检测到毒力基因hla,97.4%(225/231)的菌株检测到毒力基因hlb,98.3%(227/231)的菌株检测到毒力基因clfa,且同时携带hla、hlb和clfa等3种毒力基因的菌株占45.9%;毒力基因pvl、sea、seb和sec的检出率分别为1.73%(4/231),27.7%(64/231),29.0%(67/231)和5.6%(13/231)。介导大环内酯类抗生素耐药的耐药基因msrA、ermC的检出率分别为55.3%和67.5%。红霉素诱导克林霉素耐药的阳性率为90.3%(28/31)。结果表明:宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌毒力基因检出率较高的是hla、hlb和clfa,毒力基因的组合较复杂,耐药基因msrA、ermC的检出率也较高,并且诱导耐药阳性率所占比例较高。
2018年05期 v.38;No.257 962-967+985页 [查看摘要][在线阅读][下载 1323K] [下载次数：385 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ] - 张欣;敖日格乐;贾知锋;王纯洁;
通过酶标比浊法、试剂盒法和邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)法测定姜黄素对致病性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生长曲线、细胞壁及细胞膜渗透性的影响。同时,构建大鼠子宫内膜炎模型,用ELISA试剂盒检测各试验组中白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化情况来监测治疗效果。结果显示:(1)姜黄素对致病性S.aureus的生长曲线、细胞壁和细胞膜渗透性均有影响,因而起到抑菌的效果。当姜黄素作用于菌体细胞后,使细菌细胞壁被损伤,从而使细胞膜的通透性增加,细胞结构被破坏,从而起到抑菌的效果。(2)姜黄素中、高剂量组和环丙沙星组能显著降低患子宫内膜炎大鼠血清中的IL-6、IL-8和TNF-α的浓度,而模型组这些炎性介质的浓度不断的升高。结果表明:姜黄素的抑菌效果最佳,优于环丙沙星;姜黄素能显著抑制子宫内膜炎大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的表达来发挥调控子宫内环境动态平衡。
2018年05期 v.38;No.257 968-973页 [查看摘要][在线阅读][下载 478K] [下载次数：550 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：18 ] |[阅读次数：0 ] - 栾祖香;徐子恒;董秀凯;姚丹;蒋红;孟杰;王宏军;周铁忠;
用高效液相色谱法(HPLC)检测制剂中甘草酸的含量,二倍肉汤稀释法检测其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示:甘草颗粒中甘草酸的含量为1.451%。甘草颗粒对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为7.813g/L和15.625g/L;对大肠杆菌的抗菌活性并不明显。结果表明:利用HPLC检测甘草酸的含量,方法简单,易于操作,重复性好。甘草颗粒对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有一定的抑菌活性,为其开发为广谱抗菌药提供了理论基础。
2018年05期 v.38;No.257 974-977页 [查看摘要][在线阅读][下载 211K] [下载次数：399 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ] - 白景英;韩开顺;杜红旭;熊文;张伟;明珂;王金丽;袁文娟;刘家国;
采用三聚磷酸钠和三偏磷酸钠法制备磷酸化绞股蓝皂苷(pGP),然后运用体外细胞培养法比较研究绞股蓝皂苷(GP)和pGP抗DHAV感染鸭胚肝细胞(DEH)的作用。通过MTT法测定了GP和pGP在DEH上的安全质量浓度,并采用先加药物后接种病毒、先接种病毒后加药物和药物与病毒同时感作3种加药方式观察了GP和pGP对DHAV(duck hepatitis A virus)感染DEH的影响。为了进一步验证药物的抗病毒效果,采用实时荧光定量PCR方法比较分析了最有效药物浓度的GP和pGP对DHAV在DEH上的吸附、复制和释放的影响。结果显示:GP和pGP在一定质量浓度下均能促进DEH的生长;GP和pGP都具有较好的体外抗DHAV的作用,且在先加药后加毒和先加毒后加药作用方式下,pGP的抗DHAV的作用效果优于GP;在先加药后加病毒作用方式时,GP和pGP均能有效抑制DHAV的吸附;在先加病毒后加药作用方式时,GP和pGP对病毒吸附鸭胚肝细胞没有明显的作用,但能有效抑制DHAV的复制和释放,且pGP的抑制效果优于GP。结果表明:磷酸化修饰显著提高了GP的抗DHAV作用,pGP有希望被开发成一种新型抗DHAV药物。
2018年05期 v.38;No.257 978-985页 [查看摘要][在线阅读][下载 722K] [下载次数：149 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 王燕;柴绍明;黄燕霞;孙成彪;边红;许娜;刘文森;
取SPF级昆明小鼠进行RT雾化攻毒。攻毒后每隔一段时间通过BCA法测定小鼠支气管灌洗液BALF上清中总蛋白浓度,ELISA法测定小鼠BALF中致炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β浓度,利用RT-PCR检测小鼠肺泡巨噬细胞TLR4及其信号通路mRNA的表达情况。结果显示:小鼠吸入1/150LD50剂量雾化RT后,BALF上清总蛋白浓度增加,IL-1β、TNF-α浓度12h时达到最高值,IL-6浓度48h达到最高值。攻毒后12,24h时TLR4表达高于空白组,差异显著(0.01<P<0.05);12h时MyD88表达高于空白组,差异极显著(P<0.01)。12h时IRAK-1、IRAK-4、TRAF6表达高于空白组,差异显著(0.01<P<0.05)。结果表明:小鼠吸入1/150LD_(50)剂量雾化RT,肺部发生炎症且肺泡组织通透性增加;低浓度蓖麻毒素攻毒后可刺激肺泡巨噬细胞TLR4及其信号转导通路下游MyD88、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4等相关因子mRNA的表达,主要通过MyD88途径引起肺部炎症反应。
2018年05期 v.38;No.257 986-990+997页 [查看摘要][在线阅读][下载 1017K] [下载次数：141 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李丽莎;李兰会;李祥龙;彭永东;
以同源性较高的雪貂TYRP1基因序列(GenBank:NW_004569257.1)为模板,通过PCR扩增7个不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-Basic载体中,利用脂质体转染到A375和293T细胞,通过双荧光素酶检测系统检测活性,利用多个在线软件分别分析启动子区活性及转录因子结合位点,并构建突变体进行活性验证。结果显示:成功构建7个不同长度的启动子缺失片段重组质粒,其中6个片段具有明显的启动子活性。-367/+70区域为水貂TYRP1基因核心启动子区域,-367/-144区域的缺失,启动子活性无明显变化,-144/-37区域的缺失使启动子活性明显下降,表明该区域可能存在正调控元件。通过生物信息学方法预测可能存在Sp1转录因子结合位点,构建的Mut-Sp1-2突变体活性明显低于野生型pGL3-215,差异极显著(P<0.01)。结果表明:成功筛选了水貂TYRP1基因核心启动子区域(-367/+70),确定Sp1(-56/-45)结合位点为转录的正调控区域。
2018年05期 v.38;No.257 991-997页 [查看摘要][在线阅读][下载 1342K] [下载次数：107 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 何菊;胡迪;郭云清;李筱雯;肖运才;王喜亮;石德时;李自力;毕丁仁;周祖涛;
试验选取1日龄Cobb500肉鸡15 000只,随机分为5组,每组3 000只,每组3个重复,试验周期为42d,前期1~21d和后期22~42d。试验分组为基础日粮(A组)、基础日粮+50g/t金霉素(B组)、基础日粮+100g/t丁酸梭菌CB1制剂(C1组)、基础日粮+200g/t丁酸梭菌CB1制剂(C2组)、基础日粮+200g/t丁酸梭菌CB1复合菌制剂(D组),分别在21d和42d时每个重复随机抽取10只鸡进行屠宰取样,测定相关指标。结果显示:丁酸梭菌CB1制剂添加组C1、C2和D组42d法氏囊指数比A组、B组分别提高了347.37%,520%和400%(P<0.01),脾脏指数比B组显著提高了61.11%,46.67%和31.11%。C1、C2、D组气管黏膜SIgA水平显著高于A组和B组,C2组、D组肠道黏膜SIgA水平显著高于A组和B组。21d和42d,血糖含量C1、C2、D组与A、B组相比均有所提高,D组显著高于A和B组(P<0.05);尿素氮含量C1、C2、D组均低于A组和B组,D组显著低于A和B组(P<0.05)。21d,D组总胆固醇、肌酐也显著低于A和B组(P<0.05),但42d差异不显著。结果表明:丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂能有效促进法氏囊和脾脏的生长发育,对于后期法氏囊的生长维持作用优于抗生素和基础日粮组;能有效刺激肉鸡气管和肠道体黏膜SIgA的分泌;在一定程度上改善了肉鸡血液生化指标,复合菌制剂组在血糖含量、尿素氮指标显著优于抗生素组。
2018年05期 v.38;No.257 998-1002+1007页 [查看摘要][在线阅读][下载 612K] [下载次数：405 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：25 ] |[阅读次数：0 ] - 单奇;朱新平;谢文平;尹怡;马丽莎;刘书贵;李丽春;戴晓欣;郑光明;
6头成年健康黄牛,皮下埋置组织笼后,建立急性炎症模型,以2.2mg/kg剂量单次快速静注氟尼辛葡甲胺,高效液相色谱(HPLC)-紫外检测法测定血浆、组织液和炎症渗出液中氟尼辛葡甲胺的质量浓度,用WinNonlin药动学软件的"非房室模型"分析药动学参数。结果显示:静注氟尼辛葡甲胺后,黄牛血浆中药物质量浓度下降迅速,体内分布广泛,消除半衰期为(t_(1/2λz))为5.34h,体清除率(CL)为0.18L/kg,表观分布容积(Vd)为1.37L/kg,药-时曲线下面积(AUC)为12.33μg·h/mL;氟尼辛葡甲胺广泛地分布到组织液和炎症渗出液中,但是渗透速度慢。组织液和炎症渗出液中药物的平均达峰时间(t_(max))分别为7.12h和3.25h,峰浓度(C_(max))分别为0.65mg/L和1.44mg/L,组织液和炎症渗AUC与血浆AUC比值(AUCratio)分别为118%和214%。以上数据表明,氟尼辛葡甲胺分布到炎症组织的能力强于正常组织,组织液和炎症渗出液中药物消除均速度慢于血浆,每天静脉注射2.2 mg/kg氟尼辛葡甲胺可以在黄牛体内发挥有效作用。
2018年05期 v.38;No.257 1003-1007页 [查看摘要][在线阅读][下载 271K] [下载次数：165 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 李晓慧;耿亚楠;姜平;夏立新;刘小川;葛言亮;孙豪;杨润军;赵志辉;
以奶牛乳腺上皮细胞为材料,在克隆PRSS23基因的基础上,构建真核过表达载体和干扰载体并将其转染到奶牛乳腺上皮细胞中,利用qRT-PCR的方法检测PRSS23基因在mRNA水平上的表达情况,同时测定细胞内甘油三酯的含量。结果显示:在mRNA水平上,过表达组与对照组相比表达量差异显著,其甘油三酯水平显著升高;干扰组与对照组相比,在mRNA水平上差异表达显著,甘油三酯含量也显著升高。
2018年05期 v.38;No.257 1008-1012+1034页 [查看摘要][在线阅读][下载 1073K] [下载次数：248 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 刘健新;彭斐;黎振标;任旭皎;许古明;葛士坤;宁章勇;
为了解山羊干扰素刺激基因(stimulator of interferon genes,STING)及其编码蛋白的生物学信息,本试验采用RT-PCR法克隆了海南黑山羊STING基因并进行序列及其编码蛋白的分析,构建了pEGFP-N1-STING表达载体并转染至OFTu细胞进行了表达。结果表明STING基因的物种内同源性高、种间同源性低,编码蛋白由378个氨基酸组成,存在4个潜在跨膜区,含有1个信号肽;转染和Western blot试验证实,构建的表达载体可在OFTu细胞中成功表达。本试验为构建STING专性表达细胞系及深入研究其在山羊抗感染免疫的机制奠定了基础。
2018年05期 v.38;No.257 1013-1018页 [查看摘要][在线阅读][下载 1683K] [下载次数：136 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]
- 沈晓燕;姚大伟;龚国华;牛光斌;刘艳海;安然;杨德吉;
1例犬脑干脑炎的病例MRI诊断。该犬临床症状表现为咳嗽,呕吐,无法正常行走,面神经反射减弱,眼球震颤。患犬有上呼吸道感染病史,血常规检查显示白细胞总数升高,中性粒细胞数升高,血液生化检查无明显异常。脑脊液检查见激活淋巴细胞,单核细胞增多,为淋巴细胞总数的50%。脑部MRI表现为脑桥均匀肿大,基底部出现不规则的高T2信号,边界模糊,侧脑室扩张,综合各项检查分析诊断为脑干脑炎。
2018年05期 v.38;No.257 1019-1022页 [查看摘要][在线阅读][下载 867K] [下载次数：156 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 贾哲;张才;吴庭才;爨淑楠;邵琦;陈小燕;林霖;王宏伟;杨自军;
以改进的两步灌流法分离培养的肝细胞为研究对象,使用含油酸钠0,0.10,0.25,0.50,1.00 mmol/L的培养基对其诱导处理12h,通过油红O染色和测定细胞内TG(甘油三脂)含量判断肝细胞脂肪蓄积情况,利用CCK-8法检测细胞的活性和测定细胞培养液中ALT、AST的活性判断细胞活性和损伤程度,选取油酸浓度较为适中的组别电镜观察肝细胞超微结构的变化,荧光定量PCR技术检测油酸钠对肝细胞PPARα,SREBP-lc和ChREBP转录水平的影响,结果显示经过消化、纯化获取高纯度、高活性的肝细胞;生化指标及油红O染色结果显示:0.25mmol/L油酸钠在诱导肝细胞12h后对肝细胞损伤较小,肝细胞保持较高活性,且脂滴较明显。电镜观察结果显示:0.25 mmol/L组肝细胞线粒体空泡化严重,糖原颗粒较少的现象符合临床脂肪肝病理现象;关键脂氧化基因PPARα的表达水平升高,脂合成基因SREBP-1c、ChREBP表达水平与对照组明显降低。结果表明:油酸钠诱导奶牛肝细胞12h时,0.25mmol/L浓度的油酸钠为最佳建立体外奶牛脂肪肝细胞模型浓度。
2018年05期 v.38;No.257 1023-1028页 [查看摘要][在线阅读][下载 1873K] [下载次数：327 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：1 ] - 高瑞娟;王纯洁;敖日格乐;贾知锋;
将40只泌乳期母鼠随机分为5组(n=8)。除空白对照组(Ⅰ组)不做任何处理外,其余的在产后3~5d经乳导管分别向第4对乳头内注射20μL无菌生理盐水(阴性对照组,Ⅱ组)和低(Ⅲ组,1×107 CFU/mL)、中(Ⅳ组,1×10~8 CFU/mL)、高(Ⅴ组,1×10~9 CFU/mL)浓度大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合菌悬液。并于0,24,48,72h观察各组小鼠临床症状、组织病理学变化、乳腺的间质宽度及腺泡壁厚度和乳腺组织匀浆中TNF-α等炎症相关因子及菌落CFU含量变化。结果显示:与空白对照组相比,模型组随着注射细菌浓度增大而呈现乳腺组织病变加重;乳腺间质增宽及腺泡壁厚度减小、乳腺组织匀浆中的TNF-α、IL-6及CFU含量显著增高且差异显著。并以1×1~08 CFU/mL组炎症变化最完整,病理变化适中、不出现死亡,且小鼠病理模型的炎症病理过程和炎症反应相一致,可以诱发典型小鼠乳腺炎病理模型。结果表明:1×10~8 CFU/mL组可选为模型组。
2018年05期 v.38;No.257 1029-1034页 [查看摘要][在线阅读][下载 1334K] [下载次数：455 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 田丰松;丁赫;王军;刘畅;杨雨江;李长久;吕文发;
采用牛津杯法测定4株乳杆菌(罗伊乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌和唾液乳杆菌)对致病菌的抑菌活性,使用含有3,3,5,5-四甲基联苯胺和辣根过氧化物酶的MRS琼脂培养基测定乳杆菌产过氧化氢能力,最后通过蛋白类排除试验、抑菌物质热稳定性试验、有机酸排除试验和过氧化氢(H_2O_2)排除试验分析4株乳杆菌主要的抗菌物质。结果显示:4株菌株均具有良好的抗菌活性,约氏乳杆菌和唾液乳杆菌能够产生H_2O_2;约氏乳杆菌主要的抗菌物质为有机酸,罗伊乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌主要抗菌物质除了有机酸外,仍可以产生细菌素。结果表明:罗伊乳杆菌、格氏乳杆菌和唾液乳杆菌可以作为防治奶牛子宫内膜炎的益生菌使用。
2018年05期 v.38;No.257 1035-1038页 [查看摘要][在线阅读][下载 119K] [下载次数：150 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 王莹;徐璐;李金霞;张瑜;刘馨宇;张雪梅;
采用弗氏完全佐剂(FCA)建立大鼠佐剂性关节炎模型,设空白组、模型组、阳性组和蒲公英提取物高、中、低剂量组(10.0,5.0,2.5g/kg),分别对大鼠足趾肿胀、体质量、脾脏指数、胸腺指数和血清中TNF-α、IL-1β、PGE_2、OPG、RANKL的含量进行测定并计算RANKL/OPG,HE染色观察大鼠踝关节软骨组织及滑膜组织的病理变化。结果显示:蒲公英提取物高、中、低剂量组均不同程度降低佐剂性关节炎大鼠原发性和继发性足趾肿胀,增加体质量,下调脾脏指数和胸腺指数,抑制血清中TNF-α、IL-1β、PGE_2、RANKL的分泌,促进OPG的分泌,抑制大鼠踝关节炎性细胞浸润和滑膜增生。结果表明:蒲公英提取物对大鼠佐剂性关节炎具有一定的保护作用,为临床应用提供有效的依据。
2018年05期 v.38;No.257 1039-1044页 [查看摘要][在线阅读][下载 1126K] [下载次数：319 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：21 ] |[阅读次数：0 ]