预防兽医学

  • O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及电镜检测

    郭玉堃;郭婉莹;明胜利;杨国宇;郭豫杰;

    本试验旨在表达出高可溶性的O型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白,并通过电镜检测,以期望形成纳米样颗粒。根据O型FMDV核酸序列,得到FMDV O/GER/Wup/82株的衣壳蛋白基因,并进行截短和优化,共133个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonellaenterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Ferritin)基因片段,将O型FMDV衣壳蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了FMDV衣壳蛋白-铁蛋白基因片段,命名为SeFnt16599。构建了SeFnt16599融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的SeFnt16599融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电镜检测。结果表明,成功构建9种SeFnt16599表达载体;9个标签中,MBP与SeFnt16599蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-SeFnt16599重组蛋白质;电镜结果显示,MBP-SeFnt16599形成了纳米样颗粒。本试验建立了稳定获得SeFnt16599重组蛋白质的试验方法,为FMDV衣壳蛋白新型结构疫苗的开发及后续研究奠定了基础。

    2018年07期 v.38;No.259 1265-1271页 [查看摘要][在线阅读][下载 2141K]
    [下载次数:344 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:5 ] |[阅读次数:210 ]
  • PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析

    张涵;解长占;张世亨;李卓昕;李成辉;赵冠宇;马彬尧;尹革芬;鲁会军;金宁一;李太元;

    从云南省某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将该毒株命名为YN-LQ株。为了研究该毒株的遗传变异及分子生物学特征,根据PRRSV标准毒株NCBI登录号KC422728设计10对引物,对YN-LQ株全基因进行扩增及测序,将测序结果依次拼接获得YN-LQ株的全基因序列,并进行序列的比对分析。结果显示:PRRSV YN-LQ株基因组全长为15 320bp;将YN-LQ株与经典PRRSV病毒株Nsp2、GP5及全基因进行比对分析,发现YN-LQ株与JXA1的同源性最高。Nsp2基因序列同源性为99.0%,其氨基酸序列有15个位点发生了改变;GP5基因序列同源性为97.7%,其氨基酸序列有9个位点发生了改变;全基因的同源性为98.7%。证实该毒株为JXA1变异株,为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。

    2018年07期 v.38;No.259 1272-1275+1281页 [查看摘要][在线阅读][下载 1506K]
    [下载次数:237 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:5 ] |[阅读次数:328 ]
  • 牛传染性鼻气管炎病毒(gN-TK-gG-)三基因缺失突变株的构建

    李程;陈颖钰;索朗斯珠;郭爱珍;

    牛传染性鼻气管炎是由牛疱疹病毒Ⅰ型(BoHV-1)引起的一种牛的传染病,可导致严重的经济损失。疫苗接种是用于防控该病的重要手段,但现有疫苗在多个方面都有改进的余地。本试验利用pBoHV-1BAC载体和4次Red E/T重组,依次构建了BoHV-1gN~-(CT~-)、BoHV-1gN~-(CT~-30-32-)、BoHV-1gN~-TK-和BoHV-1gN~-TKgG-基因缺失突变株,其中gN缺失了胞外区30~32位氨基酸、胞质尾区CT端,TK基因缺失了1 079bp,gG基因缺失了1 335bp。pBoHV-1gN~-TK-gG-经磷酸钙法转染MDBK细胞后,出现细胞病变,成功拯救出三基因缺失病毒株BoHV-1gN~-TK-gG-。研究结果为牛传染性鼻气管炎新型基因缺失标记疫苗的开发奠定了基础。

    2018年07期 v.38;No.259 1276-1281页 [查看摘要][在线阅读][下载 644K]
    [下载次数:312 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:3 ] |[阅读次数:155 ]
  • 羊口疮病毒环介导等温扩增高效检测方法的建立

    王海峰;张七斤;

    羊口疮(ORF)的快速诊断对于该病的防控至关重要,而环介导等温扩增(LAMP)技术可以满足对羊口疮病毒(ORFV)高效性的现场检测需求。本试验对ORFVVIR基因扩增,通过优化反应条件,对LAMP检测ORFV进行了显色反应、特异性和灵敏性的检测,并进行了后续的临床检测。结果显示,利用优化的LAMP染色法,将呈现绿色的阳性组与橙色的阴性组区分开。对扩增的质粒和阳性对照样品的检测呈现出了阳性条带,而对山羊痘、绵羊痘、牛传染性鼻气管炎和牛副流感3型病毒的检测并无阳性条带。优化的LAMP检测ORFV的灵敏度比传统PCR高出1 000倍。对15份临床样品检测的结果表明,优化的LAMP电泳和染色法对ORFV的检出率均为100%,与传统PCR检测结果相一致。上述结果表明优化的LAMP对ORFV的检测具有特异性、高灵敏性且更加方便等优点,从而更适用于现场的高效检测。

    2018年07期 v.38;No.259 1282-1286+1306页 [查看摘要][在线阅读][下载 736K]
    [下载次数:194 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:9 ] |[阅读次数:186 ]
  • 辽宁部分地区宠物犬犬瘟热病毒分子流行病学调查与分析

    赵梓淇;宫语晨;闫飞虎;黄培;刘静;王琪;焦翠翠;张醒海;赵永坤;高玉伟;冯娜;夏咸柱;

    为了解犬瘟热病毒(CDV)遗传变异情况,先后从辽宁省沈阳、锦州、辽阳等地区的9个宠物医院收治的临床疑似犬瘟热(CD)病犬中采集了165份拭子样品及组织病料。利用CD抗原检测试纸条、RT-PCR检测方式筛选到8份阳性样品。H基因序列分析结果显示该8株CDV野毒株之间的H基因同源性为97.6%~99.9%,与疫苗(Onderstepoort)同源性为89.1%~90.9%;基因遗传进化显示,该8株毒株属于国内当前流行的Asia-1型,来源于沈阳的SY-35株与在北京发现的CDV强毒株BJ-09在同一进化分枝,其余来源于沈阳、锦州和辽阳的7株与东北地区流行的CDV在同一进化分枝;氨基酸序列比对结果显示,H蛋白在氨基酸235~245,415~425,595~605等处存在高变异,H蛋白3 555位置氨基酸的非同义置换概率相对比较高;糖基化位点以及抗原表位预测分析显示该8株CDV的H基因糖基化位点和抗原表位方面均与Asia-1型CDV野毒株相似,但与疫苗株相比变异较大,特别是我们发现JZ-6株丢失了1个潜在N-糖基化位点。结果表明:辽宁地区宠物犬CD流行以Asia-1型CDV为主,不同病毒株间存在遗传多样性。

    2018年07期 v.38;No.259 1287-1294+1358页 [查看摘要][在线阅读][下载 4614K]
    [下载次数:302 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:6 ] |[阅读次数:179 ]
  • PPRV受体信号转导淋巴细胞激活分子V区功能蛋白的表达及活性分析

    王耀杰;吴锦艳;陈妍;王光祥;尚佑军;赵兴绪;张勇;

    信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)是小反刍兽疫病毒(PPRV)感染宿主的主要细胞受体,其N端V结构域的表达活化可以启动PPRV的入侵感染。本试验选用Slam/V结构域作为功能靶标进行表达,并分析其活性。分离山羊外周血淋巴细胞,提取其基因组RNA,应用RT-PCR方法扩增山羊SLAM/V基因,构建原核表达载体pGEX-6P-1/Slam/V。将获得的重组质粒pGEX-6P-1/Slam/V转化BL21(DE3)感受态细胞,通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和验证。结果显示,IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L、37℃,诱导14h时,靶标蛋白表达量最高,融合蛋白相对分子质量约为39 800,且主要以包涵体形式存在。经山羊抗人SLAM蛋白多克隆抗体识别鉴定,证实其具有良好的免疫反应活性。本试验为建立稳定表达山羊SLAM/V功能区的阳性细胞克隆及PPRV侵染路径研究奠定了基础。

    2018年07期 v.38;No.259 1295-1299页 [查看摘要][在线阅读][下载 636K]
    [下载次数:114 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:171 ]
  • 猴D型反转录病毒Ⅰ型抗体免疫梳检测方法的建立及应用

    李丹丹;安微;陈平亚;张体银;杨俊兴;邱索平;徐义刚;高慎阳;

    为建立猴D型反转录病毒Ⅰ型抗体(SRV1)的快速检测方法,本试验采用基因工程技术制备SRV1的SRV1-30基因原核表达产物重组SRV1-30蛋白作为抗原诊断试剂,建立免疫梳方法用于特异性检测实验猴血清中抗SRV1的抗体IgG。结果显示,最佳抗原包被量为100 mg/L;制备好的免疫梳均能够特异性检测到相应的猴SRV1病毒阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应,表明该检测方法特异性强;敏感性分析结果表明,SRV1-30蛋白能够敏感地检测到1∶200倍稀释的SRV1阳性血清;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法在对12份可疑猴血清样品进行检测,免疫梳方法与ELISA检测结果一致率为100.0%,Kappa=1.000。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。

    2018年07期 v.38;No.259 1300-1306页 [查看摘要][在线阅读][下载 777K]
    [下载次数:81 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:178 ]
  • 猪肺炎支原体强弱毒株感染后呼吸道特异性sIgA抗体分泌规律差异性

    倪博;白昀;甘源;杨浩;韦艳娜;华利忠;熊祺琰;刘茂军;邵国青;冯志新;

    检验猪肺炎支原体强毒株与弱毒株感染后呼吸道sIgA抗体活性,并比较其抗体分泌规律差异。分别使用猪肺炎支原体强毒JS株和弱毒168株接种实验猪,同时设置健康猪为对照组,按时采集鼻拭子样本。通过ELISA检测0,2,4,7,14,21,28,35,42,49和56d特异性sIgA抗体滴度,比较两组抗体分泌规律。结果显示,在接种4~7d之间,强毒组已出现阳性猪,14d时所有猪呈感染阳性。而弱毒组在14~21d之间开始逐渐出现阳性猪,35d时80%左右的猪呈阳性感染,随后下降。并且强毒组抗体平均滴度高于弱毒组。结果显示,强毒转阳更早,抗体滴度更高,持续时间更长;弱毒为猪支原体肺炎弱毒疫苗株,该菌株同样保持了良好的免疫原性,可刺激呼吸道黏膜产生特异的sIgA,但黏膜抗体转阳时间较晚,滴度较低。强弱毒株在黏膜抗体分泌方面的差异有助于临床上对猪肺炎支原体的感染以及活疫苗免疫进行区别鉴定。

    2018年07期 v.38;No.259 1307-1309+1320页 [查看摘要][在线阅读][下载 302K]
    [下载次数:202 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:5 ] |[阅读次数:185 ]
  • 牛支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立

    李明霞;陈胜利;郝华芳;赵萍;季文恒;王展慧;刘永生;殷宏;储岳峰;

    牛支原体可引起牛肺炎、乳腺炎和关节炎等多系统炎症,关于其黏附宿主细胞的机理有待深入研究。本试验以牛支原体08M株和牛肾细胞MDBK为研究对象,抗牛支原体多克隆抗体为一抗,FITC标记的兔抗牛IgG为二抗,通过优化牛支原体黏附滴度、黏附时间及一抗、二抗工作浓度,建立牛支原体黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法。最终确定牛支原体的最适黏附滴度为1×109 CFU/mL,黏附时间为4h,一抗最适工作浓度为1∶250,二抗最适工作浓度为1∶250。本试验建立的间接免疫荧光方法可用于牛支原体黏附宿主细胞的检测,为牛支原体体外感染的检测及黏附机理的研究提供有效的技术手段。

    2018年07期 v.38;No.259 1310-1314+1345页 [查看摘要][在线阅读][下载 2319K]
    [下载次数:362 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:7 ] |[阅读次数:179 ]
  • 犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备及免疫学评价

    邢家恺;纪雪;孙洋;祝令伟;姜秋杰;郭学军;刘军;冯书章;

    产气荚膜梭菌是引起犬猝死症的主要病原菌,目前临床上还没有预防犬猝死症的疫苗。本试验以分离自犬的A型产气荚膜梭菌为制苗菌株,首先对利用甲醛进行产气荚膜梭菌培养液脱毒的浓度和时间进行了优化,然后利用脱毒后的产气荚膜梭菌培养液对小鼠和犬进行免疫,并对不同佐剂(铝佐剂和油佐剂)和不同免疫途径(皮下注射和腹腔注射)的免疫效果进行评价。结果显示,产气荚膜梭菌灭活疫苗具有良好的免疫保护效果,免疫后小鼠体内可产生高水平的血清抗体,抗体效价最高可达6.25×104。产气荚膜梭菌铝胶灭活疫苗对犬具有良好的安全性,单次免疫(4mL/只)或2次免疫(2mL/只)均可产生良好的免疫保护效果(5/5)。结果表明,本试验制备的犬A型产气荚膜梭菌灭活疫苗可用于预防犬产气荚膜梭菌感染。

    2018年07期 v.38;No.259 1315-1320页 [查看摘要][在线阅读][下载 352K]
    [下载次数:285 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:3 ] |[阅读次数:206 ]
  • 种鸡场孵化死胚中沙门菌的分离鉴定与耐药性分析

    徐耀辉;齐亚如;韩文龙;韩雨奇;匡秀华;蒋增海;陈益;

    为了解死亡鸡胚中沙门菌的感染状况,采集351枚孵化后期死胚进行沙门菌分离鉴定,并采用K-B法进行了20种抗菌药物的耐药表型检测,采用PCR法对6类共50种耐药基因分布进行检测。结果显示,共分离到62株沙门菌,包括6个血清型。分离菌株对磺胺异噁唑耐药情况较严重,耐药率为37.1%,对其余19种药物耐药率均在26%以下,其中对亚胺培南、美罗培南、多黏菌素E、氯霉素、呋喃妥因敏感,且有16.1%(10/62)的菌株存在多重耐药现象,最高可耐14种抗生素;此外,PCR共扩增到18种耐药基因,且6类耐药基因的检出情况与耐药表型的符合率均在60%以上,其中喹诺酮类、四环素类的符合率为100%。结果表明,该种鸡场中鸡胚源性沙门菌的血清型复杂、多重耐药情况严重,且耐药基因普遍存在于耐药菌株中,药敏试验结果与耐药基因检测结果有很高的一致性。

    2018年07期 v.38;No.259 1321-1326页 [查看摘要][在线阅读][下载 307K]
    [下载次数:203 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:6 ] |[阅读次数:172 ]
  • 大型艾美耳球虫早熟株的选育及18S rDNA系统发育分析

    崔平;方素芳;顾小龙;于小杰;梁淑珍;张丽云;李慧峰;索勋;

    通过对6株田间大型艾美耳球虫早熟选育,经20次传代,潜在期由156h缩短至132h,连续5次无选择压力传代,其潜在期不变,说明所获得的大型艾美耳球虫早熟株遗传性状稳定;早熟株与原始株卵囊的结构有差异(早熟株每个孢子囊含有1个大折光体而原始株每个孢子囊含有2个小折光体),大小差异不显著;同时对早熟株进行了系统发育分析,进化树显示:大型艾美耳球虫早熟株、原始株及GenBank中兔大型艾美耳球虫18SrDNA序列均聚为一个分支。

    2018年07期 v.38;No.259 1327-1331页 [查看摘要][在线阅读][下载 1371K]
    [下载次数:188 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:5 ] |[阅读次数:163 ]
  • 国内羊胃肠道寄生虫流行病学调查及捻转血矛线虫系统进化分析

    郭筱璐;杨怡;施宇;黄艳;时恒枝;张玲;周静茹;陈学秋;杜爱芳;

    为更好地掌握我国部分地区羊胃肠道寄生虫病的流行情况以及捻转血矛线虫ZJ株近年来的系统进化关系,从而为捻转血矛线虫病的防治提供科学依据,于2014年9—12月采集了来自山东、吉林、黑龙江、内蒙古、辽宁、河北、江苏、天津和青海9个省(市)的490份羊粪样品,对其进行了寄生虫虫卵分类鉴定,对羊寄生虫病的流行病学特征进行总结分析;此外实验室于2004—2013年采集了来自浙江省嘉兴地区的15份捻转血矛线虫ZJ株成虫样品,设计特异性引物对样品ITS-2和ND4基因进行分子克隆测序鉴定比对,对该虫近10年来的系统进化进行分析。结果表明,全国各地羊体内肠道寄生虫的感染情况均较为严重,其中感染虫种的严重程度依次为原虫(83.27%)、线虫(64.29%)和绦虫(49.80%),感染相对最为严重的3个地区分别为天津、青海和内蒙古,而相对较轻的3个地区为江苏、黑龙江、山东。对捻转血矛线虫ZJ株的15份样品进行系统进化分析显示,ITS-2和ND4基因在10年间均有不同程度的遗传变异发生,变异范围分别为0.0%~3.9%和0.4%~4.8%,而ND4突变程度较大可能是由于虫种固有差异引起的。而2种基因都有部分位点突变后与H.placei(Haemonchus pacei)相同,说明嘉兴地区可能存在捻转血矛线虫和H.placei交叉感染的情况。调查分析结果将为制定更合理的羊寄生虫病防控方案提供参考依据,并为寄生虫系统进化分析研究奠定基础。

    2018年07期 v.38;No.259 1332-1337页 [查看摘要][在线阅读][下载 2008K]
    [下载次数:426 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:31 ] |[阅读次数:185 ]
  • T-2毒素单抗制备及免疫学检测方法的建立

    郉云瑞;孙亚宁;姚静静;王英华;王方雨;闫文朝;胡骁飞;

    拟制备灵敏度高、特异性强的抗T-2毒素单克隆抗体,并初步建立T-2毒素阻断ELISA检测方法。采用N,N’-羰基二咪唑(CDI)法合成免疫原T-2-BSA和包被原T-2-OVA,经小鼠免疫、细胞融合、利用ELISA筛选技术筛选出分泌抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用腹腔注射细胞株制备腹水,并进行免疫学特性鉴定,初步建立T-2毒素阻断ELISA检测方法。结果显示,筛选出能稳定分泌抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株命名为4F7,经鉴定该细胞株分泌的单克隆抗体(mAb)效价高达1.024×106,亚型为IgG1型,亲和力常数为1.49×10~(11) mol/L,IC50为2.19μg/L,检测限LOD为0.07μg/L,与其他霉菌毒素及载体蛋白BSA和OVA交叉反应率均小于0.01%。样品回收率为83.8%~94.3%,变异系数小于15%。本试验制备出了灵敏度高、特异性强、亲和力高的T-2毒素单克隆抗体,并建立了T-2毒素的阻断ELISA快速检测方法,为T-2毒素检测提供了技术支撑。

    2018年07期 v.38;No.259 1338-1345页 [查看摘要][在线阅读][下载 606K]
    [下载次数:319 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:5 ] |[阅读次数:165 ]

人兽共患病

  • 结核分枝杆菌7种检测相关因子的原核表达及鉴定

    尹云厚;梁俊超;王雪飞;栾文静;于录;

    构建结核分枝杆菌7种蛋白的表达载体,通过原核表达得到5种休眠复苏因子蛋白,分别为(RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE)及2种潜伏相关抗原蛋白(Rv3407和Rv0569)。首先以结核菌H37Rv全基因组为模板,利用PCR技术扩增获得结核分枝杆菌的5种休眠复苏因子蛋白和2种潜伏相关抗原蛋白目的基因,克隆入pMD-18T载体,PCR和酶切鉴定准确后测序,将测序准确的目的片段分别克隆入原核表达载体pET-28a和pET-22b,经PCR和酶切鉴定准确后,转化入大肠杆菌DE3表达菌原核表达,通过SDS-PAGE和Western blot试验证实成功表达出7种目的蛋白,其中蛋白RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE为包涵体,蛋白Rv3407和Rv0569为可溶性蛋白。这7种检测相关因子蛋白的成功表达和鉴定为潜伏结核病新型检测方法建立奠定了基础,也将为进一步研究结核分枝杆菌休眠复苏机制提供依据。

    2018年07期 v.38;No.259 1346-1349页 [查看摘要][在线阅读][下载 646K]
    [下载次数:100 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:127 ]
  • 金刚烷胺抑制乙脑病毒感染引起小胶质细胞炎症反应的作用

    庄忻雨;赵翠青;赵海洋;肖朋朋;温树波;孙文超;解长占;张萍;张赫;南福龙;鲁会军;金宁一;

    目前金刚烷胺被(amantadine,Ama)用作一种抗病毒和抗帕金森药物,可抑制小胶质细胞的炎症激活。为验证金刚烷胺是否会抑制乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染小胶质细胞所引起的炎症反应,本试验利用Ama处理小鼠小胶质瘤BV-2细胞系后使用JEV感染细胞,测定细胞中炎性因子的表达,并与单独使用JEV处理BV-2细胞组进行对比分析。结果表明,Ama可以显著降低JEV感染引起的5种炎性因子的表达,MCP-1(62.17%)、IL-6(62.07%)、TNF-α(59.67%)、IL-1β(63.16%)以及IL-10(34.24%)。本试验为流行性乙型脑炎的临床治疗提供了理论依据。

    2018年07期 v.38;No.259 1350-1354+1365页 [查看摘要][在线阅读][下载 808K]
    [下载次数:162 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:4 ] |[阅读次数:199 ]
  • 陕西部分地区秦川牛断奶后犊牛隐孢子虫感染状况

    任冠静;王雪婷;荆沙;宋军科;赵光辉;

    为明确陕西部分地区秦川牛断奶后犊牛隐孢子虫感染率及其种类分布,本试验从杨凌和宝鸡3个秦川牛场采集了113份3~6月龄的犊牛粪便样品,基于隐孢子虫18SrRNA基因位点对其进行PCR检测和序列分析。结果显示,隐孢子虫总感染率为16.8%(19/113),各养殖场的隐孢子虫感染率差异不显著(P>0.05);种类鉴定发现了3种隐孢子虫,分别为安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)、瑞氏隐孢子虫(Cryptosporidium ryanae)和牛隐孢子虫(Cryptosporidium bovis),其中安氏隐孢子虫为优势虫种,广泛分布于各个养殖场。这些研究结果表明这些地区的秦川牛断奶后犊牛隐孢子虫感染比较普遍,且种类较为复杂。

    2018年07期 v.38;No.259 1355-1358页 [查看摘要][在线阅读][下载 306K]
    [下载次数:173 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:9 ] |[阅读次数:120 ]

基础兽医学

  • 冷热应激对牛PBMC和MDBK细胞活力及HSP70表达的影响

    康玲;胡丽蓉;李玮;鄢新义;亓建刚;徐青;王雅春;

    以奶牛原代培养细胞PBMC(peripheral blood mononuclear cells)和商业化细胞系MDBK(madin-darby bovine kidney)为细胞模型,采用MTS、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)及Western blot等方法检测不同程度的冷热应激对牛PBMC和MDBK细胞活力及HSP70表达水平的影响,分析不同温度的冷热应激条件下细胞活力和HSP70表达变化的规律,以及不同类型细胞应答冷热应激的差异。结果显示,冷应激和热应激均会使细胞活力降低,应激强度越大,细胞活力越低;冷热应激会调控细胞中HSP70的表达水平,重度冷应激(10℃)下调HSP70的表达,而热应激则上调HSP70的表达,但若超过细胞耐受极限度HSP70表达开始下降;HSP70表达水平应对冷热应激的变化与细胞的类型和冷热应激强度有关。结果表明,冷热应激会降低细胞活力,调控细胞HSP70的表达水平,HSP70的表达变化能够反映细胞冷热应激的强度,可作为评价奶牛冷热应激反应的澘在分子标记在奶牛个体中进行深入研究。

    2018年07期 v.38;No.259 1359-1365页 [查看摘要][在线阅读][下载 948K]
    [下载次数:291 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:9 ] |[阅读次数:206 ]
  • 黄牛肌内注射酮洛芬的药代动力学及生物利用度

    李晓虹;侯宏波;韩东东;万鹏;裴鹏飞;曾振灵;

    旨在研究黄牛静脉注射和肌内注射酮洛芬的药代动力学及肌内注射的生物利用度。选用6头健康的犊黄牛,采用双周期随机交叉试验,静脉注射和肌内注射酮洛芬的剂量均为3mg/kg体质量,采血时间点为给药前和给药后5,10,15,20,30,40,50min和1,1.5,2,3,4,6,8,10,12,14,24,30,36,48h。乙腈提取血浆中的酮洛芬,用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS-MS)测定血浆中的药物浓度。使用WinNonlin 6.2药代动力学软件对静脉注射和肌内注射的血药浓度-时间数据进行分析,均采用非房室模型拟合。静脉注射给药的主要药代动力学参数为:t1/2β(4.18±0.41)h,MRT(3.40±0.52)h,Vd(387.52±46.49)kg/mL,ClB(65.29±14.40)mL·(h·kg)-1,AUC0-∞(47.70±9.41)h·mg·L-1。肌内注射给药的主要药代动力学参数为:tmax(0.50±0.10)h,Cmax(11.24±1.41)mg/L,t1/2β(4.38±0.66)h,MRT(3.83±0.34)h,AUC0-∞(42.46±3.84)h·mg·L-1,F为(91.2±11.7)%。结果表明,犊黄牛肌内注射酮洛芬后吸收迅速,血浆中峰浓度高,消除较快,生物利用度高。

    2018年07期 v.38;No.259 1366-1370页 [查看摘要][在线阅读][下载 411K]
    [下载次数:158 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:3 ] |[阅读次数:174 ]
  • 孕哺期铅暴露对其仔鼠海马组织中突触蛋白表达的影响

    李宁;张迪;张平安;乔明武;赵秋艳;宋莲军;黄现青;李丽;崔灿;

    探讨母体受铅暴露对其后代小鼠的海马组织中突触蛋白表达的影响。铅暴露是从母体妊娠初期至断奶为止。将醋酸铅(PbAc)溶于去离子蒸馏水中,再分别浓缩至0.1%,0.5%和1%3个组作为仔鼠饮用溶液。在出生21d后,用石墨炉原子光谱吸收法测定铅指标,用免疫组织化学和Western blot检测海马组织中突触蛋白的表达。结果表明,所有铅暴露组中海马组织和血液中的铅指标均显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,突触蛋白的表达显著下降(P<0.05)。母体铅暴露引起的仔鼠海马组织中突触蛋白过少表达可能是铅神经毒性所致。

    2018年07期 v.38;No.259 1371-1374页 [查看摘要][在线阅读][下载 657K]
    [下载次数:117 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:2 ] |[阅读次数:166 ]
  • 气相色谱-串联质谱法检测鸭组织中哌嗪的残留

    王雅娟;王波;张杨杨;崔璐璐;赵霞;郭亚文;谢恺舟;张跟喜;戴国俊;吴海清;王金玉;

    建立了气相色谱-串联质谱法检测鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏以及皮肤和脂肪)中哌嗪残留的新方法。样品通过加速溶剂萃取(ASE)和固相萃取(SPE)提取、净化,乙酸酐法衍生化后用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)检测和确证。采用EI模式,SCAN和SIM扫描定性,Auto SRM结合外标法定量。在定量限(LOQs),50,100,500,1 000和2 000μg/kg的加标水平上,鸭组织中哌嗪的平均回收率为84.24%~95.49%,相对标准偏差(RSDs)为2.03%~5.30%,日内相对标准偏差为1.72%~5.01%,日间相对标准偏差为2.11%~7.35%。哌嗪在鸭组织的检测限(LODs)为1.4~1.5μg/kg(S/N≥3),LOQs为4.8~5.2μg/kg(S/N≥10),其显著低于最大残留限量(MRL)。此方法灵敏度高,定性、定量准确,适用于鸭组织中哌嗪残留的确证检测。

    2018年07期 v.38;No.259 1375-1380页 [查看摘要][在线阅读][下载 805K]
    [下载次数:107 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:3 ] |[阅读次数:179 ]
  • 丹参多糖对小鼠免疫性肝损伤中炎症因子的调控

    韩超;杨金凯;王霄;陶金良;包永占;史万玉;

    将60只昆明小鼠随机分为正常对照组,LPS模型组,丹参多糖高、中、低(500,250,125mg/kg)保护组,每组12只。保护组用相应剂量的丹参多糖连续灌胃7d,1次/d。模型组和正常组给以等剂量的生理盐水。模型组和保护组在末次灌胃1h后,腹腔注射LPS(10mg/kg)建立肝损伤模型;正常对照组腹腔注射等体积的生理盐水。各组小鼠于注射LPS 2h后,眼球取血分离血清,测定其血清谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)的活性和TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10含量;HE染色观察肝组织形态学变化;RT-PCR检测肝组织中TNF-α、INF-γmRNA的表达。结果显示,与正常对照组相比,LPS模型组小鼠血清AST、ALT活性和TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10含量均显著增加(P<0.05或P<0.01)。丹参多糖各保护组(500,250,125mg/kg)均可显著降低AST、ALT的活性和TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10的含量,并可减少肝组织中TNF-α、INF-γmRNA的表达。且丹参多糖对肝损伤的这种保护作用呈现一定的剂量依赖性。结果表明,丹参多糖对免疫性肝损伤具有显著的保护作用,且这种保护作用可能与丹参多糖降低炎症因子水平有关。

    2018年07期 v.38;No.259 1381-1385页 [查看摘要][在线阅读][下载 1095K]
    [下载次数:264 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:17 ] |[阅读次数:163 ]
  • 甘草酸体外抗PRRSV的作用机制

    胡安君;毕亚楠;杨婉莉;杜芳芳;王学兵;张红英;

    为了研究甘草酸体外抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞的作用及机制,本试验确定了甘草酸的抗PRRSV作用,并通过检测甘草酸对病毒的吸附侵入、核酸复制等环节对病毒的结构蛋白、非结构蛋白以及宿主细胞受体和IFN-α表达的影响确定甘草酸体外抗PRRSV的作用机制。结果显示,甘草酸阻断PRRSV感染时减少了GP4的表达,并降低CD163和CD151的表达;抑制PRRSV吸附时抑制了PRRSV GP4和细胞CD163的表达;抑制PRRSV侵入时抑制了GP4的表达,并显著提升细胞CD163和CD151的表达;抑制增殖的作用机制是抑制细胞内PRRSV nsp9和nsp10的表达,前期抑制病毒引起的TLR3表达升高的趋势,后期促进TLR3的表达;中后期降低、末期促进IFN-α的表达。结果表明,甘草酸能通过调节PRRSV的蛋白、宿主细胞受体和细胞因子的表达来抑制PRRSV体外感染Marc-145细胞。

    2018年07期 v.38;No.259 1386-1393页 [查看摘要][在线阅读][下载 1704K]
    [下载次数:331 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:22 ] |[阅读次数:148 ]

临床兽医学

  • 不同蛋白源低蛋白日粮对肥育猪血液生化指标及小肠氨基酸转运载体表达量的影响

    白晓鹭;孙会;曹克飞;张海环;郭昊璐;

    在低蛋白(11%)日粮添加合成氨基酸至必需氨基酸平衡的条件下,研究不同蛋白源日粮对肥育猪血液生化指标及小肠氨基酸转运载体表达量的影响。选取48头体质量为(58.65±3.71)kg杜×长×大杂交肥育猪,随机分为4个组,每组设4个重复。对照组饲喂正常蛋白水平(15%CP)日粮(SBM15),3个处理组饲喂低蛋白水平(11%CP)日粮,分别为豆粕组(SBM11),豆粕+棉籽粕+玉米胚芽粕组(SCCM11),棉籽粕+玉米胚芽粕组(CCM11)。按照标准回肠可消化氨基酸需要量添加合成氨基酸至日粮必需氨基酸平衡。结果表明:SCCM11、CCM11组的尿素氮含量显著低于SBM15、SBM11组(P<0.05)。SCCM11组的胰岛素含量显著低于其他各组,胰岛素样生长因子1(IGF-1)含量显著高于其他各组(P<0.05)。CCM11组的总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶含量显著低于其他各组,胆固醇含量显著高于其他各组(P<0.05)。SBM15组的CAT1在十二指肠、空肠前段、回肠的表达量显著高于SBM11、SCCM11、CCM11组(P<0.05),但SCCM11组的EAAC1、CAT1、B~0AT1在空肠后段、回肠的表达量均显著高于CCM11组(P<0.05)。因此,饲喂SCCM11组日粮可以显著降低尿素氮的生成,提高了肥育猪对蛋白质、糖、脂类等营养物质的吸收效率并增加了EAAC1、CAT1、B~0AT1在空肠后段及回肠的表达。

    2018年07期 v.38;No.259 1394-1399页 [查看摘要][在线阅读][下载 292K]
    [下载次数:480 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:10 ] |[阅读次数:177 ]
  • 高产奶牛产后卵巢静止血液临床病理学变化及其预警评估

    钱伟东;李昌盛;白云龙;夏成;张洪友;徐闯;杨威;

    选择黑龙江省2个牛场高产奶牛,在产后60~90d调查卵巢静止,检测发情和卵巢静止奶牛生殖激素,能量代谢,肝功能和矿物质等指标,通过Pearson相关分析、二元Logistic分析和ROC分析对牛场产后卵巢静止进行预警评估。结果显示:2个牛场(Ⅰ,Ⅱ)卵巢静止发病率分别为29.5%,47.2%,主要由于产后早期能量负平衡。2个牛场卵巢静止组与发情组相比,血浆中β-羟丁酸(BHBA)、游离脂肪酸(NEFA)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)均显著的升高。牛场Ⅰ,当产后60~90d奶牛血浆中BHBA>0.94 mmol/L、NEFA>0.56 mmol/L、AST>95.5U/L时;牛场Ⅱ,当奶牛产后60~90d血浆中BHBA>1.00mmol/L、NEFA>0.585mmol/L、AST>103.5U/L时;奶牛患卵巢静止的风险增高。结果表明,奶牛产后发生的能量负平衡可扰乱奶牛发情周期的生殖激素分泌,是引起2个牛场奶牛产后卵巢静止的主要病因。奶牛泌乳早期血浆中NEFA、BHBA和AST等指标可用于产后卵巢静止的风险预警。

    2018年07期 v.38;No.259 1400-1405页 [查看摘要][在线阅读][下载 310K]
    [下载次数:127 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:8 ] |[阅读次数:159 ]
  • 青黛散体内外抗炎作用

    周霄楠;赵兴华;钟秀会;

    选用体质量18~22g的昆明小鼠为研究对象,采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型及棉球肉芽肿模型,观察青黛散水煎液对体内炎症过程的影响;选用体质量1.7kg左右的青年獭兔为研究对象,采用苯酚致家兔口腔溃疡模型观察溃疡愈合时间及组织学的变化,以研究青黛散对口腔溃疡的治疗作用。体外试验采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导的RAW264.7细胞炎症模型,观察青黛散水煎液对体外炎症过程的影响。结果显示,青黛散水煎液高剂量组可显著抑制(P<0.05)小鼠耳肿胀及棉球肉芽肿的发生;其高剂量组可显著促进(P<0.05)苯酚致家兔口腔溃疡的愈合时间;青黛散高剂量组的家兔口腔溃疡在6d内全部愈合。青黛散组家兔的口腔黏膜组织切片中可见大量成纤维细胞及少数炎性细胞存在。青黛散水煎液可极显著地抑制(P<0.01)LPS诱导RAW264.7细胞后NO及TNF-α水平的升高,且呈剂量依赖性。结果表明,青黛散在体内和体外均具有良好的抗炎效果。

    2018年07期 v.38;No.259 1406-1411页 [查看摘要][在线阅读][下载 1048K]
    [下载次数:316 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:7 ] |[阅读次数:141 ]
  • 高脂饮食对犬生化指标及血液流变学的影响

    李玉;陶焕青;何坤;徐怡钟;郝宁;邹苏萍;李敏;冯士彬;王希春;吴金节;

    本试验旨在研究高脂饮食对犬生化指标和血液流变学指标的影响。选取本地50只健康的45日龄杂交犬,随机分为两组,正常组15只,高脂组35只,分别饲喂基础饲料(正常组)、高脂饲料(高脂组)。试验为12周。每隔1周,采集1次血清,用于检测血清生化指标。于试验最后1d,每组随机选择15只犬,采集抗凝血,用于检测血液流变学指标。结果表明:与正常组检测结果相比,高脂组犬血清中TC、TG和LDL-C浓度均显著升高(P<0.01或P<0.05)。高脂组犬的全血黏度、红细胞压积、血浆黏度、全血高低切相对指标和全血高切还原黏度均显著升高(P<0.01或P<0.05)。由此可见,给予犬高脂饮食可出现高脂血症,并且血液流变学指标会发生明显的变化,对于犬高脂血的临床诊断,具有理论指导意义。

    2018年07期 v.38;No.259 1412-1415+1429页 [查看摘要][在线阅读][下载 533K]
    [下载次数:273 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:4 ] |[阅读次数:170 ]
  • PERK在玉米赤霉烯酮诱导TM4细胞凋亡中的作用

    冯楠楠;王冰洁;郑王龙;司梦雪;邹辉;顾建红;袁燕;刘学忠;刘宗平;卞建春;

    以TM4细胞(小鼠睾丸支持细胞株)为材料,用不同浓度的玉米赤酶烯酮(zearalenone,ZEA)染毒,利用透射电子显微镜(设0,5,10,20μmol/L ZEA浓度组),流式细胞仪、Western blot等技术检测了细胞超微结构、凋亡率、凋亡相关调控蛋白以及内质网应激相关蛋白的变化(设0,0.1,1,10,20μmol/L ZEA浓度组);通过转染PERK(蛋白激酶R样内质网激酶)siRNA,沉默PERK基因后检测了ZEA诱导TM4细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的变化。结果显示:与对照组相比,20μmol/L浓度组损伤最为严重。随着ZEA浓度的增加,细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的值逐渐升高,cleaved caspase 9、cleaved caspase 3蛋白表达量均呈升高趋势,1μmol/L以上染毒组均较各自对照组有极显著差异(P<0.01);内质网应激相关蛋白BIP、CHOP的表达量也呈升高趋势,10μmol/L以上染毒组BIP、0.1μmol/L以上染毒组CHOP的表达量均较对照组有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01);PERK通路蛋白含量在10μmol/L时最高,20,30μmol/L时逐渐降低,但各染毒组与对照组相比呈显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01);TM4细胞caspase3的活性和凋亡率均呈升高趋势,10μmol/L以上染毒组caspase3的活性较对照组均有极显著差异(P<0.01),各染毒组细胞的凋亡率较对照组均有极显著差异(P<0.01)。与10μmol/L ZEA处理组相比,siRNA PERK+10μmol/L ZEA组细胞凋亡率呈显著下降(P<0.01),Bax/Bcl-2比值、cleaved caspase 3、cleaved caspase 9表达量均下降(P<0.05或P<0.01)。结果表明,ZEA可触发TM4细胞内质网应激,通过PERK-eLF2α-ATF4信号通路诱导细胞发生凋亡,PERK信号通路在ZEA诱导TM4细胞凋亡中发挥重要作用。

    2018年07期 v.38;No.259 1416-1423页 [查看摘要][在线阅读][下载 2887K]
    [下载次数:239 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:6 ] |[阅读次数:172 ]

动物科学

  • 吉林白鹅毛囊发育及IGF-1、EGF基因对其发育调控的影响

    刘逍;娄玉杰;

    旨在研究吉林白鹅毛囊发育以及IGF-1、EGF基因对毛囊发育过程调控的影响。选择保存7d内的吉林白鹅种蛋300枚,饲养到出雏后28d。分别在孵化期23(E23),27(E27)d,出雏后0,1,4,7,14,21,28d取样,共9个处理组,将E23作为对照组,每个处理6个重复,采用单因素完全随机试验设计,测定初级毛囊和次级毛囊密度、毛球直径、IGF-1、EGF基因在皮肤中的相对表达量。结果表明,吉林白鹅E23~28d,初级毛囊密度显著降低(P<0.05),初级毛囊毛球直径显著增加(P<0.05),次级毛囊密度显著增加(P<0.05),次级毛球直径显著增加(P<0.05)。吉林白鹅胸部为主要产绒部位。吉林白鹅E23~28d皮肤中IGF-1、EGF基因相对表达量显著增加(P<0.05)。IGF-1和EGF基因可以促进次级毛囊的发育,对吉林白鹅毛囊发育起到了调控的作用。

    2018年07期 v.38;No.259 1424-1429页 [查看摘要][在线阅读][下载 403K]
    [下载次数:151 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:6 ] |[阅读次数:146 ]
  • TCDCA对大鼠脂肪代谢及其相关受体FXR表达量的影响

    李欣;牛春宇;毛伟;关红;何秀玲;李培锋;

    为了探讨牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)对大鼠脂肪代谢相关受体FXR表达量的影响,初步分析TCDCA对脂肪代谢的调节作用。将36只雄性Wistar大鼠,随机分成4组:阴性对照组、低剂量组(3mg/kg)、中剂量组(9 mg/kg)及高剂量组(27mg/kg),给药持续21d后,收集肝脏。采用HE染色和免疫组化方法检测FXR是否在大鼠肝脏组织中的表达及其表达位置,以及TCDCA对大鼠肝脏组织结构的影响;采用qPCR和Western blot的方法测定大鼠肝脏FXR mRNA以及相应蛋白的表达量。结果表明,阴性对照组与TCDCA各给药组大鼠肝脏细胞核上的FXR均有表达,但TCDCA处理组的表达量明显高于阴性对照组;TCDCA对大鼠肝脏组织结构物无显著影响;低剂量组大鼠肝脏中FXR mRNA表达量极显著高于阴性对照组(P<0.01),低剂量组FXR蛋白表达量显著高于阴性对照组(P<0.05)。TCDCA对大鼠脂肪代谢相关受体FXR的表达量呈上调作用。

    2018年07期 v.38;No.259 1430-1434+1456页 [查看摘要][在线阅读][下载 2325K]
    [下载次数:179 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:9 ] |[阅读次数:176 ]
  • Wnt10b在乾华肉用美利奴羊毛囊周期中的表达规律

    程晓印;姜怀志;

    为研究Wnt10b在乾华肉用美利奴羊毛囊发育周期中的表达规律,试验采用荧光定量RCR、免疫印迹与免疫组化方法对兴盛期(9月)、退行期(1月)、休止期(3月)皮肤中Wnt10b的表达规律进行了测定。结果从基因与蛋白水平上证明,Wnt10b的表达具有规律性,兴盛期表达量最高,主要表达于毛母质细胞,内外根鞘也有少量表达;退行期表达量逐渐减少,进入休止期后表达量降至最低,几乎不表达。进一步说明Wnt10b对乾华肉用美利奴羊毛囊的周期性生长具有重要的调节作用。

    2018年07期 v.38;No.259 1435-1439页 [查看摘要][在线阅读][下载 1250K]
    [下载次数:101 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:11 ] |[阅读次数:166 ]

综述

  • 牛支原体黏附和侵入宿主细胞的研究进展

    李明霞;郝华芳;赵萍;季文恒;翟肖辉;刘永生;陈胜利;储岳峰;

    牛支原体可引起牛的肺炎、乳房炎和关节炎等一系列重要疾病,给养牛业造成严重的经济损失。黏附和侵入是牛支原体定殖和感染宿主的关键步骤,是毒力的重要组成部分。本文主要描述了牛支原体对不同宿主细胞的黏附和侵入方式,并简单介绍了牛支原体黏附相关蛋白及其作用,以期为今后牛支原体致病及免疫逃避机制的研究提供参考。

    2018年07期 v.38;No.259 1440-1444页 [查看摘要][在线阅读][下载 139K]
    [下载次数:481 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:13 ] |[阅读次数:180 ]
  • MDCC-MSB-1细胞增殖抑制机制研究进展

    张佩琪;李真诚;王宜平;岑美珍;刘进辉;纪春晓;

    MDCC-MSB-1细胞是鸡马立克氏病毒(MDV)诱导产生的T淋巴细胞增生性肿瘤细胞系之一,已被作为模型广泛应用于抗肿瘤药物的研究中。本文旨在探讨与MDCC-MSB-1细胞周期被阻滞在G1期的调控因子作用机制,以及诱导MDCC-MSB-1细胞凋亡的信号传导通路。MDV所致瘤细胞增殖抑制机制的深入研究,为人类肿瘤病的治疗研究提供良好的动物模型展望,也为新型药物的开发开辟出新的思路。

    2018年07期 v.38;No.259 1445-1450页 [查看摘要][在线阅读][下载 142K]
    [下载次数:242 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:2 ] |[阅读次数:160 ]
  • siRNA在调控破骨细胞分化和骨吸收中的研究进展

    仝锡帅;顾建红;刘宗平;

    RNAi是指将外源性或内源性的双链RNA导入目的 mRNA序列,特异性转录后基因沉默,又称为转录后基因沉默,广泛应用于基因组学、疾病治疗筛选、药物靶点等众多领域。本文主要介绍破骨细胞(OC)分化和吸收过程中重要的调控分子及信号通路,应用RNAi技术特异性地干扰OC分化和吸收中的相关调控分子及信号通路,找到骨代谢相关疾病的关键靶点,旨在为预防及治疗骨代谢相关疾病提供新的方向和思路。

    2018年07期 v.38;No.259 1451-1456页 [查看摘要][在线阅读][下载 151K]
    [下载次数:162 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:1 ] |[阅读次数:133 ]

简讯