预防兽医学

  • 变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)S和N融合双基因质粒的构建及鉴定

    王隆柏;王晨燕;吴学敏;陈秋勇;车勇良;周伦江;

    为构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和N融合双基因质粒并表达出相应的蛋白,通过扩增变异PEDV的S和N基因,将S基因连接到pEAS-Blunt M2(M2)真核表达载体,构建M2-S质粒,通过同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至M2-S基因片段,再转化到Trans1-T1感受态细胞中,构建M2-S-N融合双基因质粒。将M2-S-N融合双基因质粒转染到293T细胞,可表达出相应的S-N融合双基因蛋白。利用RT-PCR、Western blot技术和免疫BLAB/c鼠试验鉴定载体及蛋白表达的免疫活性,结果成功构建了M2-S-N融合双基因质粒,并表达出具有免疫原性的S-N融合双基因蛋白,且该蛋白能够诱导小鼠产生特异性抗体。变异PEDV的S和N基因融合双基因质粒的构建,为进一步开展变异PEDV的诊断技术及基因工程疫苗等研究奠定良好基础。

    2018年12期 v.38;No.264 2241-2246页 [查看摘要][在线阅读][下载 542K]
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  • 猪流行性腹泻病毒S1蛋白B细胞表位原核表达及间接ELISA方法的建立

    陈金龙;许可军;李芬;刘通;于智慧;刘晓萌;董林;魏凤;沈志强;许崇友;王金良;

    应用DNAStar软件在猪流行性腹泻病毒S1蛋白70~280位氨基酸序列间预测出1个优势B细胞抗原表位,氨基酸序列为IARLRICQFP,命名为PEP3。借助基因工程技术成功对PEP3进行融合表达,经动物试验、Western blot和间接免疫荧光试验均表明,PEP3蛋白具有良好的抗原性。基于PEP3蛋白建立的ELISA检测方法,与用N蛋白建立的检测方法的符合率为95.94%;该方法具有较高的敏感性和良好的特异性,批内和批间变异系数分别为1.68%~4.65%和4.21%~9.32%。研究表明,本试验建立的基于PEP3蛋白的ELISA检测方法特异性强、敏感性好、重复性高,可以用于临床样本的检测,丰富了现有的猪流行性腹泻病的诊断防控技术。

    2018年12期 v.38;No.264 2247-2251+2257页 [查看摘要][在线阅读][下载 999K]
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  • 猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型二重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法的建立

    韩昊莹;赵宇;郑慧华;张鸿鑫;侯华琳;贾会斌;陈红英;

    根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因序列和猪博卡病毒(PBoV)不同基因型VP1基因序列,设计2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PBoV3/4/5型VP1基因,回收扩增产物分别克隆入pMD~18-T载体,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的模板,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PBoV3/4/5型的二重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法线性关系良好,能特异、敏感性检测PEDV与PBoV3/4/5型;对PEDV与PBoV3/4/5型的最低检测极限分别为72.6copies/μL和76.9copies/μL,为常规PCR方法的100~1 000倍;本研究建立的PEDV和PBoV3/4/5型荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。

    2018年12期 v.38;No.264 2252-2257页 [查看摘要][在线阅读][下载 845K]
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  • 猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒二重Luminex x-TAG方法的建立

    朱余军;徐宁;肖丽;伍妙梨;饶丹;徐凤娇;练月晓;黄韧;郭鹏举;陈梅丽;

    为了建立一种快速、特异、灵敏且能同时检测猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)二重Luminex x-TAG方法,参照GenBank中PPV的NS-1基因序列和PRV的ICP8基因序列,设计了2对特异性引物,其中上游引物5′端加一段TAG序列,下游引物5′端用生物素标记,进行二重PCR扩增。然后将PCR产物与链霉亲和素-藻红蛋白、磁珠混匀,42℃孵育25min,混合物在Luminex200仪器上进行读数分析。并用该方法进行特异性、灵敏度、重复性及临床样品的检测。结果显示,该方法与其他猪的病原无交叉反应,两者的检测下限都可达1×102 copies/μL,批内批间的变异系数都在4%以下;在30份临床样品中,PPV和PRV的检出率分别为13.3%和60.0%,比普通PCR的检出率高。结果表明,本研究建立的二重Luminex x-TAG方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测PPV和PRV两种病毒,可用于猪场中PPV和PRV的流行病学调查。

    2018年12期 v.38;No.264 2258-2261页 [查看摘要][在线阅读][下载 399K]
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  • 免疫和非免疫猪场猪圆环病毒2型抗体及病毒检测分析

    范志新;邢福珊;谢宇飚;欧阳玥玲;赵紫印;吴萌萌;周宏超;姜艳芬;郭抗抗;

    疫苗免疫是防控猪圆环病毒2型(PCV2)感染的重要措施,但在疫苗免疫猪场也存在PCV2感染的情况,为了探究免疫猪场出现病毒感染的可能原因,本研究对7个规模化疫苗免疫猪场和2个非疫苗免疫猪场共计262份血清样品进行PCV2抗体和病毒检测,分析比较疫苗免疫猪场和非免疫猪场PCV2分离株的全基因组序列,从基因差异方面探讨免疫猪场发生PCV2感染的可能机制。结果显示,免疫猪的平均血清抗体阳性率为65.17%(116/178),最高为88.89%(24/27),最低为26.67%(8/30),说明不同猪场存在较大差异;非免疫猪的平均抗体阳性率为15.48%(13/84),猪场PCV2阳性率为100.00%(2/2),说明检测的猪场均存在PCV2的感染。通过常规PCR从抗体阳性的6份猪血清中扩增到PCV2全基因组序列(2个来自免疫猪场,4个来自非免疫猪场)。基因分析发现,该6个PCV2毒株的基因组全长均为1 767bp;6个毒株之间Rep基因序列相似性为97.1%~99.8%,与GenBank中收录的国内外24个分离株之间的相似性为94.2%~100.0%,具有较高的保守性;6个毒株之间Cap基因序列相似性为82.7%~99.2%,与国内外24个分离株之间的同源性为78.5%~98.1%,Cap基因的变异程度较大。对免疫猪场分离株和非免疫猪场分离株全基因组序列的比对并未显示出显著性差异,说明这两类猪场感染的PCV2毒株并未出现明显的变异。结果表明,疫苗免疫在PCV2感染的防控中具有重要作用,免疫猪场出现病毒再次感染主要是各种原因造成的免疫失败所致,免疫猪场感染的PCV2毒株并未出现明显的变异,而对PCV2感染的防控中除了要做好疫苗的免疫接种外,良好的饲养管理和兽医卫生措施至关重要。

    2018年12期 v.38;No.264 2262-2266+2270页 [查看摘要][在线阅读][下载 630K]
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  • 同时检测猪瘟病毒、圆环病毒2型抗体的液相芯片法

    肖丽;石欣鹭;练月晓;饶丹;黄碧洪;黄韧;郭鹏举;陈梅丽;

    通过液相芯片新技术建立了一种同时检测猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、圆环病毒2型(porcine circovirus typeⅡ,PCV2)抗体的方法。研究方法及步骤包括:分别原核表达CSFV E2蛋白和PCV2Cap蛋白,与荧光微球偶联;偶联后的微球与各个标准血清反应,利用Luminax系统检测藻红蛋白的荧光信号强弱,从而建立抗体检测方法。该方法经过验证后,结果显示特异性良好,与其他猪病原抗体无交叉反应;批内及批间变异系数均在10%以内,稳定性好。与ELISA方法对比发现,液相芯片法的灵敏度均高于ELISA方法,CSFV和PCV2分别提高4,8倍。临床样品符合率分别是90.48%,60.32%。本研究为同时检测CSFV和PCV2抗体提供一种新方法。

    2018年12期 v.38;No.264 2267-2270页 [查看摘要][在线阅读][下载 211K]
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  • 新疆地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

    任衍倍;乌那尔汗;孟凡峰;董桂伟;张玉标;王文;马晓艳;居马别克;盛卓君;常爽;赵鹏;

    为了解目前新疆维吾尔自治区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学特征,应用PCR方法对新疆14个地区猪场送检的共430份病料进行PCV2的检测,并对阳性样品的基因组进行了扩增和克隆测序,分析研究PCV2遗传变异情况。结果显示,430份样品中,有21份样品为PCV2阳性,阳性率为4.88%。经序列比较和遗传进化分析对21株PCV2进行了基因型鉴定,其中2份样品为PCV2a(9.52%),3份样品为PCV2b(14.29%),15份样品为PCV2d(71.43%),1份样品为PCV2e(4.76%)。与其他基因型相比,新疆地区PCV2优势基因型PCV2dORF2的特异性氨基酸位点主要集中在第53I、89L、90T、121T。结果表明,目前新疆地区的PCV2以PCV2d基因型为主,同时也伴有其他类型,本研究为更好地掌握新疆地区PCV2的流行情况、基因组特性进而提出针对性防控措施提供参考数据。

    2018年12期 v.38;No.264 2271-2276页 [查看摘要][在线阅读][下载 663K]
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  • 福建省新发猪圆环病毒3型分子流行病学调查及其Cap基因分子特征

    黄翠琴;范克伟;余佳;宋洲洋;杨守深;戴爱玲;杨小燕;刘建奎;林青青;费世港;林宏彬;周存锐;陈冠果;张跃鸿;

    为了解2015―2017年福建省新发猪圆环病毒3型(PCV3)的流行现状、分子生物学特征和遗传演化规律,收集福建省不同地区186个猪场的267份疑似PCV3感染猪的组织病料进行分子流行病学调查,并对其Cap基因进行了遗传变异分析。结果显示,福建地区PCV3猪场总阳性率为30.11%,疑似样品总阳性率为21.72%,且呈逐年增高的趋势;17株PCV3福建分离株与其他17株国内外参考毒株Cap基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性较高,分别为96.0%~100.0%和96.3%~100.0%,表明这些毒株可能有相同的进化来源;氨基酸多序列比对发现,Cap基因氨基酸序列最有特征性的是第168位(R→K)和173位(L→F)的氨基酸替换,该位点的突变可能是该地区流行的PCV3毒株的一个重要分子特征;同时,抗原性分析发现第173位(L→F)的突变还位于Cap蛋白的抗原表位区内。遗传进化树分析结果表明,17株PCV3福建分离株中有2株属于3a亚型,其余15株属于3b亚型,表明当前福建地区PCV3流行毒株主要为3b亚型。

    2018年12期 v.38;No.264 2277-2282页 [查看摘要][在线阅读][下载 741K]
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  • 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗不同免疫程序对细胞因子分泌的影响

    丁尊俄;胡兴义;张双翔;周碧君;王开功;赵双成;欧伟业;肖焕星;秦文学;文明;程振涛;李如举;

    为分析仔猪首次免疫猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弱毒疫苗对血清细胞因子分泌水平的影响,本试验筛选PRRSV抗原与抗体均为阴性的7日龄仔猪40头,平均分为4组,其中试验A、B、C组均为14日龄首次免疫经典弱毒疫苗,试验A组35日龄二免用高致病性灭活疫苗,试验B组35日龄二免用经典弱毒疫苗,试验C组35日龄注射生理盐水,对照组均注射生理盐水。分别于首免后1,2,3周和二免后1,2,3,4,5,6周前腔静脉采血分离血清,采用细胞因子ELISA方法检测IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10和IL-12细胞免疫水平。结果显示,仔猪14日龄首次免疫弱毒疫苗后能迅速分泌细胞因子,首免3周以内,试验组IFN-γ分泌量均高于对照组,差异极显著(P<0.01);试验组TNF-α分泌量高于对照组,差异极显著(P<0.01),且试验A组>试验B组>试验C组,其差异不显著(P>0.05);试验组IL-2分泌量高于对照组,试验A组最高,其差异显著(P<0.05);试验组IL-10分泌量高于对照组,试验C组最高,其差异显著(P<0.05);试验组IL-12分泌量高于对照组,试验A组最高,其差异显著(P<0.05)。35日龄二免弱毒疫苗或灭活疫苗3周后,除IFN-γ外,试验A组的TNF-α、IL-2、IL-10和IL-12分泌水平均高于试验B组和试验C组。结果表明,14日龄首免PRRSV弱毒疫苗和35日龄二免PRRSV灭活疫苗的免疫效果优于仅单独2次免疫PRRSV弱毒疫苗或1次免疫PRRSV弱毒疫苗。

    2018年12期 v.38;No.264 2283-2288页 [查看摘要][在线阅读][下载 154K]
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  • 鹅多瘤病毒VP1基因的克隆及EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

    万春和;刘荣昌;程龙飞;施少华;傅光华;陈红梅;傅秋玲;陈翠腾;黄瑜;

    针对鹅多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)VP1基因核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,从1株樱桃谷鸭源GHPV(命名为FJ201601株)扩增获得VP1基因核苷酸序列全长,并进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其VP1基因分子特征。基于GHPV各分离株VP1基因特点,设计特异性的实时荧光定量PCR引物,建立基于EvaGreen实时荧光定量PCR检测GHPV方法。结果显示,克隆的FJ201601株VP1基因全长为1 062bp,与GHPV各参考分离株核苷酸同源性为99.7%~100.0%;在遗传进化上可将GHPV分为2个大的遗传进化分支(Clade 1和Clade 2),FJ201601株属于Clade 2分支。建立的EvaGreen检测GHPV实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线方程y轴截距为39.12,斜率为-3.489,扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.7%;敏感性强,最低检测限为88.0拷贝/μL;特异性好,扩增产物的溶解曲线分析只出现单一的特异峰,Tm值为(82.18±0.22)℃,无引物二聚体,对水禽常见病原检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%~1.76%和0.92%~2.44%。用建立的检测方法对80份多品种生长不良鸭进行检测发现4份阳性(樱桃谷鸭2份、麻鸭2份),阳性率为5%(4/80)。本研究证实麻鸭中存在GHPV感染,为丰富GHPV感染宿主谱和开展GHPV感染流行病学调查和致病机理研究提供检测手段。

    2018年12期 v.38;No.264 2289-2295页 [查看摘要][在线阅读][下载 1175K]
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  • 我国新出现的基因Ⅻ型新城疫病毒(NDV)的基因组特性

    王静静;吕艳;郑东霞;赵云玲;戈胜强;罗瑶瑶;魏润宇;刘华雷;王志亮;

    为了解我国新出现的基因Ⅻ型新城疫病毒(NDV)的分子特性,分析其基因组遗传演化特征,对2010―2012年我国首次分离到的3株基因Ⅻ型新城疫代表株进行基因组测序和生物信息学分析。结果显示,3株病毒F蛋白裂解位点相同为112 RRQKR/F117,符合强毒株特征。病毒基因组长度均为15 192nt,与早期基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)毒株相比,其在NP基因5′端非编码区有6个核苷酸插入。3株病毒在F蛋白信号肽、七肽重复区和跨膜区,以及HN蛋白跨膜区、中和抗原表位等功能区有多处氨基酸变异。病毒基因组遗传进化分析结果显示,3株病毒均属于基因Ⅻ型,但与南美地区分离株不同(基因Ⅻa亚型),我国分离株为基因Ⅻb亚型。

    2018年12期 v.38;No.264 2296-2300页 [查看摘要][在线阅读][下载 328K]
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  • 广东地区规模化鸡场地方鸡种禽白血病净化的初步研究

    郑麦青;李鹏;刘泽;邢思远;范红结;

    鉴于地方鸡种禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)感染的严峻形势,本研究在参考国际禽白血病净化"金标准"的基础上,结合现阶段地方品系/配套系种鸡的特点,制定了ALV净化方案;同时应用该方案对广东地方黄羽肉鸡品种C系和D系的6个世代净化效果进行了跟踪追溯,结果取得较好的成效。经过5个世代的净化更替,C系和D系鸡群p27抗原阳性率分别由19.40%和42.88%下降到0.00%和0.22%;A/B亚群抗体阳性率由5.17%(28/542)和4.73%(7/148)下降到2.23%(21/917)和1.50%(3/200);J亚群抗体由4.67%(23/492)和2.70%(4/148)下降到1.81%(16/883)和0.00%(0/248);病毒分离阳性率由2.14%(18/841)和2.16%(7/324)下降到0.37%(2/537)和0.64%(2/314);雏鸡胎粪p27抗原检出率分别是C系0.086%(13/15 080)和D系0.128%(17/13 273)。以上结果表明,通过净化程序的实施,鸡群ALV阳性率显著下降,净化方案效果明显。

    2018年12期 v.38;No.264 2301-2305+2310页 [查看摘要][在线阅读][下载 457K]
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  • 母源抗体及不同疫苗对小反刍兽疫疫苗免疫的影响

    郝飞;李文良;毛立;李基棕;杨蕾蕾;张纹纹;孙敏;刘茂军;江杰元;

    为了解影响小反刍兽疫(PPR)疫苗免疫效果的因素,并为制定科学合理的PPR免疫程序提供依据,本试验选取不同PPR母源抗体水平的羔羊进行分组并免疫PPR疫苗;于不同时间免疫PPR、羊痘、口蹄疫疫苗,定期采血,采用商品化ELISA试剂盒检测抗体变化水平。结果表明,母源抗体严重干扰PPR疫苗的免疫效果,免疫羊痘疫苗和口蹄疫疫苗不会对PPR疫苗的免疫效果产生干扰。因此,在生产实际中需要做好羔羊PPR母源抗体水平的监测,根据监测结果制定科学合理的免疫程序。

    2018年12期 v.38;No.264 2306-2310页 [查看摘要][在线阅读][下载 717K]
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  • 2株分离乳酸菌对奶牛阴道上皮细胞的黏附作用

    牛春宇;程超;王潇;刘彦民;黄少磊;李培锋;

    益生乳酸菌对奶牛阴道上皮细胞黏附能力的强弱是其发挥益生作用的前提条件,因此黏附能力是筛选益生菌的重要标准之一。为筛选出可以制备微生态制剂的益生乳酸菌菌株,本试验采用碳氢化合物黏着法、紫外分光光度法、酶联免疫吸附法,测定了2株乳酸菌SQ0048、SQ0054及混合菌株的疏水性能、自凝集能力、生物被膜形成能力及其影响因素,并采用瑞士吉姆萨染色法研究了2株乳酸菌及其混合菌株对奶牛阴道上皮细胞的黏附作用。结果显示,菌株SQ0048以及混合菌株在不同pH值条件下对正十二烷的疏水作用极显著性高于二甲苯(P<0.01);在3h时,菌株SQ0048在pH5时的自凝集能力极显著高于pH7和pH6时的自凝集能力(P<0.01);菌株SQ0048在pH5时的成膜能力最强,为强被膜生物形成株,菌株SQ0054为弱被膜生物形成株,混合菌株也为弱被膜生物形成株;混合菌株对奶牛阴道上皮细胞的黏附性极显著高于2株单一乳酸菌(P<0.01),2株单一乳酸菌对奶牛阴道上皮细胞的黏附具有协同作用。结果表明,2株乳酸菌及其混合菌株均具有良好的黏附能力,而混合菌株更适合用于微生态制剂的研发。

    2018年12期 v.38;No.264 2311-2315页 [查看摘要][在线阅读][下载 386K]
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  • B型多杀性巴氏杆菌感染诱导NLRP3炎症小体激活及IL-1β分泌

    雷桂花;雷泽慧;巫芮;蒋兵;陈玉凤;杨加朝;方仁东;彭远义;

    为研究B型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida serotype B,PmB)感染巨噬细胞后诱导IL-1β成熟与分泌的机理,本研究用PmB分别体外感染WT、Casp1~(-/-)、Asc~(-/-)和Nlrp3~(-/-)小鼠巨噬细胞,通过ELISA、qRT-PCR和Western blot方法检测上述感染体系中IL-1β的表达与分泌,并通过检测PmB黏附和侵入巨噬细胞的情况,阐述吞噬作用对IL-1β分泌的影响。结果显示,PmB感染WT小鼠巨噬细胞后能够引起IL-1β的表达与分泌,但感染Casp1~(-/-)、Asc~(-/-)、Nlrp3~(-/-)小鼠巨噬细胞后IL-1β的分泌受损且极显著低于WT小鼠(P<0.01),表明Caspase-1、ASC、NLRP3蛋白均参与IL-1β的成熟与分泌过程;此外,PmB感染巨噬细胞后,可检测到成熟形式的Caspase-1,表明Caspase-1在IL-1β的分泌过程中发挥着重要作用。进一步研究发现,巨噬细胞吞噬PmB的作用对IL-1β的分泌有促进作用,抑制巨噬细胞吞噬作用后IL-1β的分泌同样受到显著影响(P<0.01)。结果表明,PmB感染巨噬细胞后通过激活NLRP3炎症小体信号通路活化Caspase-1,促进IL-1β的成熟与分泌发挥抗感染作用,同时IL-1β的分泌与巨噬细胞的吞噬作用相关,为研究PmB的致病机理以及疾病治疗的诊断靶标提供一定依据。

    2018年12期 v.38;No.264 2316-2321页 [查看摘要][在线阅读][下载 859K]
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  • 3种致毛皮动物肺炎病原菌多重PCR检测方法的建立

    吴同垒;王洪彬;陈玥;高桂生;张志强;史秋梅;

    大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌是引起毛皮动物肺炎的最为常见的细菌性病原。本研究选择3种细菌的特异性基因,分别为phoA(大肠杆菌)、plcH(铜绿假单胞菌)和khe(克雷伯菌)基因,进行多重PCR方法的建立,预期扩增目的条带大小分别为720,199,428bp。通过反应条件的优化,选择退火温度54.5℃,引物体积(按照phoA、plcH和khe顺序,浓度10μmol/L)为0.50,0.75,2.00μL。敏感性试验结果显示,大肠杆菌和肺炎克雷伯菌最低检测DNA质量浓度为1mg/L (1μL),而铜绿假单胞菌的最低检测质量浓度为100μg/L (1μL)。利用建立的多重PCR方法对临床样品进行检测,结果表明该方法能够有效检测出3种病原菌。

    2018年12期 v.38;No.264 2322-2326页 [查看摘要][在线阅读][下载 1256K]
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  • 羊毛尾线虫凉山州分离株的线粒体cox1和Cyt b基因的序列测定及种系发育分析

    郝桂英;王赵伟;

    应用PCR技术对分离自四川省凉山州12个山羊源羊毛尾线虫分离株的线粒体cox1基因部分序列(pcox1)和Cyt b基因部分序列(pCyt b)进行扩增和分析。结果显示,所获得的羊毛尾线虫pcox1和pCyt b序列长度分别为843bp和909bp,种内变异分别为0.0%~0.5%(7个变异位点)和0.0%~0.1%(1个变异位点),分别检测到7个单倍型和2个单倍型,平均单倍型多样性分别为0.773和0.409,核苷酸多样性分别为0.001 74和0.000 45。构建的种系发育树均显示,12个山羊源羊毛尾线虫凉山州分离株聚在同一小分支,能与其他毛尾线虫相鉴别;不同宿主来源的羊毛尾线虫中国株均聚在同一分支,而羊毛尾线虫西班牙株单独聚为一支,推测不同地方羊毛尾线虫分离株可能存在隐藏种或不同的基因型。结果表明,羊毛尾线虫cox1和Cyt b基因序列种内变异小,种间差异较大,故可作为分子标记用于羊毛尾线虫的种间鉴定;羊毛尾线虫凉山州分离株存在一定的遗传变异和遗传多样性,且cox1基因的多样性水平高于Cyt b基因。本研究结果为羊毛尾线虫的分子分类、群体遗传结构和分子流行病学调查等的进一步研究奠定基础。

    2018年12期 v.38;No.264 2327-2333页 [查看摘要][在线阅读][下载 701K]
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人兽共患病

  • 犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救与鉴定

    文兆海;毛丽萍;胡远;程瑶;周海莹;陈凯云;翟少华;简子健;

    探究犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救及鉴定,为后期犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒活疫苗的研制奠定基础。采用脂质体转染的方法,将纯化后的重组质粒(pcDNA-N-G-EGFP-CDVN-PM-L)与辅助性表达质粒(pcDNAN、pcDNA-G、pcDNA-P、pcDNA-L)共转染BSR细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光技术进行检测并鉴定。结果显示,对盲传至第6代、第9代病毒液进行RT-PCR检测,均出现与预期相符的目的片段(狂犬病病毒N基因片段大小为1 315bp,犬瘟热病毒CDV-N基因片段大小为1 653bp)。间接免疫荧光试验后在激光共聚焦显微镜下,试验组均可观察到大量绿色荧光表达。RT-PCR结果与间接免疫荧光试验结果相吻合,表明犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒拯救成功。

    2018年12期 v.38;No.264 2334-2338页 [查看摘要][在线阅读][下载 603K]
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  • 禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法的建立

    王潇;曹琛福;黄超华;林彦星;花群义;贾伟新;

    为建立一种特异、灵敏、简便、快速的禽流感病毒H5亚型的检测方法,根据近几年流行的禽流感病毒H5亚型毒株HA基因序列,采用DNAStar生物分析软件进行基因序列比对后,选择相对保守区域,设计多对引物及探针,建立了禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法,对该方法的反应条件进行优化并检测特异性和灵敏性。结果显示,建立的检测禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA方法特异性强,只有禽流感病毒H5亚型呈阳性,其他均为阴性;灵敏性较高,最低可检测到质量浓度为0.89×10-3 mg/L的禽流感病毒H5亚型核酸,比实时荧光RT-PCR方法灵敏性低10倍;检测快速,检测反应所需时间仅20min,比实时荧光RT-PCR方法缩短近1h。结果表明,所建立的禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法适应于禽流感病毒H5亚型的现场检测,以及基层实验室的推广应用。

    2018年12期 v.38;No.264 2339-2342+2347页 [查看摘要][在线阅读][下载 447K]
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  • 连云港市售海鱼异尖线虫感染情况的初步调查

    徐杨;曾巧英;孙志华;张藜潇;王楠;刘晓雷;白雪;王光明;刘明远;

    异尖线虫病是一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病,人类由于生食或半生食含有异尖线虫Ⅲ期幼虫的海鱼而引起感染,严重威胁人类健康。据报道我国沿海地区海鱼仍有异尖线虫感染,为了解我国黄海海域连云港市售海鱼异尖线虫的寄生情况,于2017年3―10月对该地市售海鱼的感染情况进行了形态学观察与PCR鉴定。随机选取本地海鲜市场采购的不同种类海鱼,剖检鱼体、分离其内脏和肌肉中Ⅲ期幼虫;应用多重PCR方法进行分子生物学鉴定。结果显示,19种海鱼中有11种被检出有异尖线虫感染(57.89%),海鱼的总检出率为37.89%,带鱼、小黄花鱼、梭鱼、黑鱼检出率最高为100.00%,鲳鱼、鲈鱼、鮟鱇鱼、海鲫鱼、沙丁鱼、黄姑鱼、白姑鱼、巴浪鱼均未检出异尖线虫;阳性海鱼平均感染强度为5.24条/尾,总体平均感染强度为1.99条/尾,带鱼感染强度最高为10.60条/尾;感染部位以肠和肠系膜最为严重,占虫体数67.55%。多重PCR鉴定本次获得的虫体为简单异尖线虫、派氏异尖线虫、伪地新线虫和内湾宫脂线虫,其中简单异尖线虫为优势种。结果表明,连云港市售海鱼异尖线虫具有较高的感染率和感染强度,本次调查为连云港市人群预防和控制该病提供了理论依据,对异尖线虫病的流行病学研究具有重要意义。

    2018年12期 v.38;No.264 2343-2347页 [查看摘要][在线阅读][下载 343K]
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  • 迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ原核表达及免疫原性

    张志强;杨楠;李永慧;苏硕青;冯东青;吴同垒;高桂生;钱爱东;史秋梅;

    为研究迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌flgJ基因,构建重组载体pET-32a-flgJ,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白大小约54 000;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌分离株ET-13进行攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为70%。本研究克隆了迟缓爱德华菌外膜蛋白flgJ基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组FlgJ蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。

    2018年12期 v.38;No.264 2348-2351+2359页 [查看摘要][在线阅读][下载 661K]
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基础兽医学

  • 单多羔湖羊下丘脑转录组比较分析

    郑健;李奉哲;冯旭;杨花;杨鹏程;王锋;张艳丽;

    通过对湖羊下丘脑组织进行转录组分析,旨在挖掘影响多羔性状的关键功能基因。分别选取三羔组湖羊(n=3)和单羔组湖羊(n=3),利用转录组测序(RNA-Seq)技术对下丘脑cDNA文库进行测序和生物信息学分析,然后采用实时定量PCR验证差异基因在下丘脑组织中的表达情况。通过比较分析转录组数据,共筛选出56个差异基因,其中三羔组中有24个基因上调,32个基因下调。GO分类注释显示,差异基因与器官发育、信号传导、转录调控等生物学过程存在密切关联,同时与DNA结合、蛋白结合、ATP结合等分子事件表现活跃。KEGG通路分析显示,神经信号传递通路、γ-氨基丁酸信号通路可能在湖羊下丘脑调控排卵及卵泡发育方面发挥着重要的调控作用。随机选择5个差异表达的基因进行q-PCR验证,定量结果与测序结果一致。本研究结果为进一步阐述湖羊下丘脑的基本分子机理奠定基础,同时也为全面理解湖羊多羔特性提供新的思路。

    2018年12期 v.38;No.264 2352-2359页 [查看摘要][在线阅读][下载 1205K]
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  • 生长抑素基因疫苗pVAX1-TRX-SS的构建及对猪生长的影响

    黄志鹏;陈婷;孙加节;习欠云;史合群;张永亮;

    用带有生长抑素CDS(sequence coding for amino acids in protein)区的引物,以pET32a(+)中的TRX标记基因为模板,扩增获得生长抑素(somatostatin,SS)-硫氧还原蛋白(thioredoxin,TRX)基因,并将该段基因插入pVAX1质粒载体中,构建pVAX1-TRX-SS真核表达质粒,酶切和测序鉴定表明质粒构建正确。用Lipofectamine~2000Reagent将上述质粒转染CHO细胞进行瞬时表达,24h后提取细胞总蛋白,Western blot能检测到目的蛋白。选取60日龄去势公猪18头,随机分为3组,分别于半膜肌注射0mg(生理盐水),1mg和2mg pVAX1-TRX-SS质粒,生理盐水对照组为Ⅰ组,1mg和2mg组分别为Ⅱ和Ⅲ组,注射后用活体基因导入仪电击处理。结果显示,免疫后5周,Ⅱ组和Ⅲ组平均日增重分别比Ⅰ组提高13.92%(P<0.05)和11.40%(P>0.05),料重比分别降低了6.19%和3.33%(P>0.05)。免疫后2周,Ⅱ组血清中生长抑素含量显著低于Ⅰ组;Ⅲ组血清中生长抑素含量则在免疫后4周显著低于Ⅰ组。Ⅱ组生长抑素抗体阳性率于免疫后4周达到峰值80%,Ⅲ组则在免疫后4周达到80%并维持到免疫后6周。上述结果表明,pVAX1-TRX-SS真核表达质粒能在真核细胞中表达,免疫猪后使猪产生了生长抑素抗体,有效中和了内源性生长抑素,对猪的生长有一定促进作用。

    2018年12期 v.38;No.264 2360-2365页 [查看摘要][在线阅读][下载 506K]
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  • 北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

    郑晓宁;王瑞宁;王亚琪;郭敏;巩元芳;刘铮铸;彭永东;李祥龙;

    通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P<0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。

    2018年12期 v.38;No.264 2366-2373页 [查看摘要][在线阅读][下载 1114K]
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临床兽医学

  • 铜通过活性氧诱导鸡肝细胞发生焦亡

    廖建昭;杨帆;裴若男;刘德琴;陈慧莲;张卓炜;张裕恒;唐兆新;

    为探讨铜是否能诱导肝细胞发生焦亡及其发生机制,本研究通过培养鸡原代肝细胞,以不同浓度的硫酸铜(0,10,50,100μmol/L)处理细胞24h,CCK-8法检测细胞活力,实时荧光定量PCR检测细胞焦亡相关基因Caspase-1、IL-1β、IL-18、NLRP3的mRNA转录水平,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中焦亡相关蛋白Caspase-1、IL-1β、IL-18的含量,并使用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)与铜共同作用于肝细胞后观察上述指标的变化。结果显示,铜可诱导细胞存活率下降(P<0.05),焦亡相关基因Caspase-1、IL-1β、IL-18和NLRP3表达显著上调(P<0.05),并促使细胞上清液中Caspase-1、IL-1β和IL-18的含量升高(P<0.05);NAC与铜联合作用可使肝细胞存活率较铜单独作用显著升高(P<0.05),焦亡相关基因表达显著下调(P<0.05),相关蛋白含量也显著降低(P<0.05)。结果表明,铜可通过活性氧诱导鸡肝细胞发生焦亡。

    2018年12期 v.38;No.264 2374-2378页 [查看摘要][在线阅读][下载 1255K]
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  • 不同水平玉米赤霉烯酮对断奶仔猪卵巢发育的影响

    刘秀凤;黄丽波;孙雪萍;张文磊;邵明慧;杨晨;杨在宾;袁学军;姜淑贞;

    为了研究不同水平玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对断奶仔猪卵巢发育的影响,选择40头健康三元杂交(杜×长×大)断奶雌性仔猪,体质量(14.01±0.86)kg,随机分为4组,每组10头。对照组饲喂基础饲粮,3个试验组分别在基础饲粮基础上添加0.5(ZEA0.5)、1.0(ZEA1.0)和1.5(ZEA1.5)mg/kg的ZEA。预试期10d,正试期35d。组织学观察发现,添加ZEA后仔猪卵巢组织结构发生改变,各处理组原始卵泡明显减少,生长卵泡明显增多,ZEA1.5组生长卵泡多发生闭锁。免疫组化、RT-PCR和Western blot检测结果显示,添加不同水平ZEA后卵巢中PCNA、Bax及Bcl-2表达出现明显的异常;PCNA和Bax表达量显著上调,且ZEA1.0组高于ZEA0.5组,其次是ZEA1.5组;而Bcl-2的表达量呈剂量依赖性减少,ZEA1.0和1.5组与对照组相比差异极显著(P<0.01)。结果表明:饲粮添加0.5~1.5mg/kg ZEA可引起断奶仔猪卵巢的卵泡提前发育甚至闭锁,主要途径是诱导PCNA、Bcl-2及Bax基因异常表达,引起卵巢卵泡异常发育。

    2018年12期 v.38;No.264 2379-2386页 [查看摘要][在线阅读][下载 5272K]
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  • 几种药物对脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)分泌炎性因子的影响

    冯峰;马维武;管翠萍;周学章;

    通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)建立体外炎症模型,探究不同药物对炎症模型细胞分泌炎性因子的抑制作用,为阐明药物抗炎机制奠定基础。本研究通过CCK-8法筛选LPS的最佳致炎剂量,确定细胞炎症模型;将氟尼辛葡甲胺、亚硫酸氢钠穿心莲内酯、苦木、莲胆作用于炎症模型细胞,以地塞米松作为阳性对照,ELISA法检测各组细胞培养液上清中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达变化情况。研究发现,经LPS(10mg/L)刺激BMECs 24h,炎症模型组细胞培养上清中TNF-α和IL-1β的含量显著高于空白对照组(P<0.05),IL-6的含量极显著高于空白对照组(P<0.01);氟尼辛葡甲胺(10mg/L)、亚硫酸氢钠穿心莲内酯(5mg/L)、苦木(5mg/L)、莲胆(5mg/L)在使用质量浓度下均能不同程度地抑制炎症模型组BMECs分泌TNF-α、IL-6和IL-1β,其中亚硫酸氢钠穿心莲内酯对炎症细胞具有很好的抗炎作用,为以后体内的抗炎作用研究奠定基础。

    2018年12期 v.38;No.264 2387-2391页 [查看摘要][在线阅读][下载 509K]
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  • 氦氖激光对实验兔皮肤全层切伤的疗效观察

    陈晓丽;张诗薇;池漫锋;白霖;许文虹;刘晓玲;辜银萍;石达友;

    选取年龄、体质量相近的4月龄健康实验兔18只制备皮肤全层切伤模型,随机分为3组,模型对照组、京万红治疗组和激光治疗组。于试验中不同时间点采集耳缘静脉血液,检测白细胞数、单核细胞数、巨噬细胞数和血小板总数;分离血清检测血清AST、ALB、TP、TGF-B1、VEGF、PDGF和NGF水平;每组随机取1只实验兔的创面皮肤,进行组织学检查。结果显示,在整个试验期间,模型对照组感染死亡率为33.3%,京万红治疗和激光治疗组感染死亡率均为16.67%。试验第14天京万红治疗和激光治疗组实验兔血液中的白细胞数显著低于对照组;激光治疗组血液中血小板数明显高于其他2组。试验第3天与模型对照组和京万红治疗组相比激光治疗组血清中VEGF浓度显著增加。组织切片观察结果显示,皮肤组织切面愈合速度分别为激光治疗组>京万红治疗组>模型对照组。结果表明,氦氖激光照射和京万红软膏在实验兔皮肤创伤治疗中均有显著疗效,但激光治疗组的疗效优于京万红治疗组,值得今后在临床中加以推广应用。

    2018年12期 v.38;No.264 2392-2397页 [查看摘要][在线阅读][下载 2308K]
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动物科学

  • 油菜花粉超微粉对肉鸡免疫功能和抗氧化能力的影响

    廖吕燕;陈小权;李健;王长康;马玉芳;黄一帆;

    180羽1日龄体质量相近的爱拔益加(AA)肉鸡随机分为4个组,每组3个重复,每个重复15羽。Ⅰ组为空白对照组,饲喂基础日粮,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别在基础日粮的基础上添加0.5%,1.0%,1.5%的油菜花粉超微粉,试验期间自由采食、饮水,试验期42d,试验结束后采血分离血清检测相关免疫及抗氧化指标。结果显示,在饲粮中添加油菜花粉超微粉能显著提高肉鸡胸腺指数(P<0.05),显著提高肉鸡血清免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)和血清白细胞介素IL-2、IL-6的含量(P<0.05或P<0.01);同时能显著提高肉鸡血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性(P<0.05或P<0.01),并降低血清丙二醛含量(P<0.05)。上述结果表明,在饲粮中添加油菜花粉超微粉能显著增强肉鸡免疫功能,提高其抗氧化能力,且添加剂量以1.5%为最佳。

    2018年12期 v.38;No.264 2398-2403页 [查看摘要][在线阅读][下载 153K]
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  • 丙酮酸和乳酸代谢对猪卵母细胞体外核成熟的作用

    温晶;王国梁;巩帅;解洪立;谭景和;

    关于卵母细胞成熟过程中糖代谢的研究主要集中在糖酵解和PPP途径上,而对丙酮酸和乳酸代谢的报道较少。本研究据此探讨猪卵母细胞体外核成熟过程中丙酮酸和乳酸的代谢途径及对卵母细胞核成熟的影响。以不含能量物质的NCSU-23为基础培养基,添加不同浓度的丙酮酸钠或乳酸钠及单羧酸转运蛋白(MCT)抑制剂4-CIN、线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮或乳酸脱氢酶抑制剂草氨酸钠,培养猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)或裸卵(DOs),观察核成熟率。结果表明,添加15mmol/L丙酮酸钠时,COCs和DOs核成熟率最高,分别为(69.5±3.1)%和(54.7±2.6)%;同时添加4-CIN或鱼藤酮显著(P<0.05)降低COCs和DOs核成熟率;添加3mmol/L乳酸钠时COCs和添加10mmol/L乳酸钠时DOs的核成熟率达到最高,分别为(72.1±1.7)%和(41.1±2.3)%;同时添加草氨酸钠显著(P<0.05)降低COCs和DOs的核成熟率。以上结果说明:(1)猪COCs和DOs均能代谢丙酮酸和乳酸支持其核成熟;(2)丙酮酸通过MCT跨膜转运进入线粒体并经线粒体呼吸链代谢支持卵母细胞核成熟;(3)乳酸通过LDH催化生成丙酮酸和NADH来维持卵母细胞核成熟;(4)猪COCs比DOs对丙酮酸和乳酸的利用能力强,说明卵丘细胞对卵母细胞成熟至关重要。

    2018年12期 v.38;No.264 2404-2409页 [查看摘要][在线阅读][下载 158K]
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综述

  • 尼帕病的传播途径及风险因子

    杨紫君;常臻;蔡玉梅;柴同杰;

    尼帕病毒(Nipah vrius,Niv)的天然宿主是果蝠,病毒可通过被果蝠排泄物污染的水果传染给猪,人可通过与病猪接触或饮用Niv污染的枣椰树汁感染,并形成人与人之间的Niv传播。自1998年马来西亚首次报道该病以来,新加波、印度、孟加拉国等9个国家流行过该疫病,造成近千人感染,约50%患者死亡,对公共卫生造成严重威胁。我国虽没有该疫病的相关报道,但与疫区的生猪走私、水果贸易、人员交流等加大了尼帕病传入的风险,而且果蝠在我国东南地区的自然分布也存在尼帕病的原发可能性。现通过尼帕病的起源、病原特性、易感动物、传播途径等因素来分析尼帕病的风险因子,确定其人畜共患的危害性,为更好地控制该病的输入,制定合理的防控应急预案提供参考。

    2018年12期 v.38;No.264 2410-2413页 [查看摘要][在线阅读][下载 129K]
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  • 鸡毒支原体对大环内酯类抗生素的耐药判定标准研究现状

    黄安雄;王淑歌;李俊;黄玲利;王旭;刘振利;郝海红;袁宗辉;

    鸡的慢性呼吸道疾病是鸡常发的一种传染病,对家禽养殖业有非常大的危害,其致病菌主要是鸡毒支原体。大环内酯类抗生素是治疗鸡毒支原体病的常用药物之一,但由于不规范用药的问题,致使鸡毒支原体对大环内酯类抗生素产生了一定的耐药性,而且呈现越来越严重的趋势。为了指导临床合理用药,进而有效控制耐药性问题,制定耐药判定标准是必要条件。现综述了鸡毒支原体对大环内酯类抗生素耐药判定标准的研究现状,根据美国和欧盟耐药判定标准制定程序,为我国制定鸡毒支原体对大环内酯类抗生素的耐药判定标准奠定基础。

    2018年12期 v.38;No.264 2414-2423+2431页 [查看摘要][在线阅读][下载 257K]
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  • 动物源性食品中抗球虫药物残留的色谱和质谱检测技术研究进展

    王雅娟;张杨杨;郭亚文;谢恺舟;赵霞;卜晓娜;刘楚君;

    综述了常用抗球虫药在动物源性食品中的残留检测方法,主要对液相色谱法、液相色谱质谱联用法、气相色谱质谱联用法等进行了简单的介绍,分析了各种色谱和质谱检测方法的优缺点,并对各种抗球虫药物残留的色谱和质谱检测方法的发展趋势进行了展望,为我国动物源性食品中抗球虫药物的色谱质谱检测技术提供理论依据。

    2018年12期 v.38;No.264 2424-2431页 [查看摘要][在线阅读][下载 192K]
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  • 猪圆环病毒3型检测方法研究进展

    张爱琼;梁海英;曾智勇;王彬;徐国;叶百川;何小莉;咸文;

    为了更好地掌握新型猪圆环病毒3型(PCV3)快速、准确而方便的检测方法,现就近两年来国内外相继报道的一种与猪皮炎和肾病综合征、生殖功能衰竭和多系统炎症相关的PCV3主要检测方法包括宏基因组、常规PCR、多重定量实时聚合酶链反应(mqPCR)、TaqMan实时PCR、实时重组酶聚合酶扩增(rt-RPA)、间接ELISA进行了综述,旨在为PCV3流行情况提供可靠的检测方法。

    2018年12期 v.38;No.264 2432-2435+2440页 [查看摘要][在线阅读][下载 145K]
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  • 部分国外名校动物医学专业建设中的特色与创新

    魏述永;吴俊伟;陈红伟;华玲;周洋;

    我国畜牧业正处于从传统养殖模式向集约化养殖模式的转型期,加之宠物医疗行业的兴盛,社会对提高动物医学专业人才培养质量的要求日益强烈。发达国家动物医学专业办学历史悠久、理念先进、经验丰富,有众多值得国内同行学习和借鉴之处。以发达国家部分兽医名校为代表,从人才培养体系、教学理论与方法、特色训练项目等方面综述了其特色和创新之处,为国内动物医学专业的教学、科学研究与发展提供参考。

    2018年12期 v.38;No.264 2436-2440页 [查看摘要][在线阅读][下载 146K]
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