- 刘金凤;杜毅超;白安斌;陈凤莲;覃绍敏;马玲;孟菲;吴健敏;
旨在利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达融合VP22短肽的重组猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白VP2,分析其免疫原性。以PPV N株为模板,通过重叠延伸PCR技术分别将VP22融合到VP2基因的N端或C端,构建重组杆状病毒rBV-VP2、rBV-VP22-VP2和rBV-VP2-VP22,通过感染昆虫细胞进行重组蛋白的表达,并在小鼠上初步验证其免疫原性。间接免疫荧光和Western blot分析结果表明表达产物均能与鼠抗PPV抗体发生特异性反应;透射电镜观察到rBV-VP2、rBV-VP22-VP2的表达产物可装配形成直径约22～24 nm的病毒样粒子,VP2-VP22没有观察到病毒样粒子。PPV ELISA抗体检测结果显示,3种表达产物均能有效诱导小鼠产生PPV特异性抗体,其中VP2、VP22-VP2组产生抗体水平与PPV灭活苗相当;细胞因子检测结果显示,3种表达产物均能有效刺激细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,其中VP22-VP2组IL-2和IFN-γ的含量要显著高于VP2和PPV灭活苗组及重组蛋白VP2-VP22组,表明VP2 N端融合VP22蛋白的免疫效果要优于其C端,VP22-VP2虽不能提高VP22蛋白的体液免疫效果,但具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力。
2019年05期 v.39;No.269 813-820页 [查看摘要][在线阅读][下载 1809K] [下载次数：246 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李成辉;肖朋朋;赵冠宇;张克龙;李卓昕;南福龙;陈竞;张涵;马彬尧;韩继成;金鑫;田明尧;鲁会军;金宁一;
建立蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)RT-PCR检测方法,用于2018年云南省库蠓的蓝舌病(BT)流行病学检测。设计2对保守引物,优化RT-PCR方法的退火温度、循环次数、退火时间和延伸时间,并进行灵敏性和特异性评价。采集了昭通市3个县及普洱市澜沧县的BT传播媒介库蠓共25万余只,进行研磨后,用建立的RT-PCR方法检测样本。筛选出1对引物BTVS10-F和BTVS10-R作为蓝舌病毒RT-PCR检测引物,敏感度达到10~(2.5) TCID_(50)/0.1 mL,通过对BTV16型的阳性病毒检测,证实该方法的可行性。
2019年05期 v.39;No.269 821-825页 [查看摘要][在线阅读][下载 774K] [下载次数：340 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 原霖;李尔华;董浩;陈亚娜;鞠厚斌;张红丽;王林;宋晓晖;杨林;王传彬;
为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)国家核酸标准物质,将PRRSV美洲变异株代表毒株PRRSV JXA1接种Marc145细胞,出现细胞病变后,反复冻融并收集病毒液,并灭活分装。制备后进行均匀性、稳定性评估、数字PCR法定值、不确定度分析和临床试用。结果表明,制备的标准物质的定值为:(1.13±0.18)×10~4拷贝/μL,样品均匀;-20℃可稳定保存12个月以上、4℃可稳定2个月以上。经全国标准物质管理委员会的专家评审,该制备物达到了国家二级标准物质要求,可以作为核酸扩增检测PRRVS的核酸标准物质。
2019年05期 v.39;No.269 826-829页 [查看摘要][在线阅读][下载 114K] [下载次数：232 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 王艳梅;顾敬敏;雷连成;冯新;孙长江;韩文瑜;
为了发现并验证猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)保护性抗原GP5蛋白羧基端新的中和性表位,本研究运用生物信息学软件预测PRRSV GP5蛋白羧基端的抗原性,全基因合成GP5蛋白羧基端168～198位氨基酸的编码序列,构建了重组噬菌体M13-GP5aa168～198,以临床阳性血清进行Western blot分析重组噬菌体表面展示的GP5aa168～198多肽的免疫反应原性。以1.0×10~(13) PFU/mL重组噬菌体混合氢氧化铝佐剂制备免疫抗原,按照灭活疫苗免疫程序肌肉注射免疫PRRSV抗体阴性断乳仔猪2次,间隔2周,分别于末次免疫后的第2,4和6周采血,分离血清,以临床分离PRRSV强毒株进行中和试验。结果显示:重组噬菌体表面展示的GP5aa168～198多肽具有免疫反应原性,免疫仔猪后,能够诱导仔猪产生较高水平的中和性抗体,为构建PRRSV GP5新型多表位疫苗的开发奠定了基础。
2019年05期 v.39;No.269 830-834+841页 [查看摘要][在线阅读][下载 630K] [下载次数：310 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 陈超;田野;李海娥;薛瑞雪;陈书民;刘存;张月;姜世金;田夫林;
为了调查山东省使用Bartha-K61疫苗免疫后,猪场猪伪狂犬病(PR)仍旧流行的原因,本研究对山东省动物疫病预防与控制中心在免疫猪场分离到的12株PRV的gC基因进行克隆测序与分析。核苷酸和氨基酸比对结果表明PRV欧美毒株与国内毒株亲缘关系较远,序列具有明显的地域特征,而大部分国内2011年后的分离毒株在氨基酸进化树上位于同一个分支,这表明gC基因的变异具有一定的时间特征。国内毒株gC蛋白的氨基酸与Bartha株的比对结果显示两者在24个位点上存在差异,并且国内毒株在63位之后增加了7个氨基酸AAASTPA。通过对LDZ01-2014毒株与Bratha株的gC蛋白抗原指数、亲水性和表面可及性分析发现两者的差异主要体现在gC蛋白的氨基端1/3部分,以期获得部分山东省Bartha-K61疫苗免疫失败的原因,并为以后的病原学研究和PR的有效防控提供参考。
2019年05期 v.39;No.269 835-841页 [查看摘要][在线阅读][下载 1169K] [下载次数：137 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 潘力;林树乾;于可响;李桂明;杨世发;宋玲玲;董雯雯;李颖;逯月;王林;王振勇;
本试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)呼吸型M41标准株的S1基因设计并合成引物,构建了阳性质粒标准品;经过不断优化建立了检测IBV-M41 SYBR GreenⅠReal-Time PCR标准曲线。通过对8日龄SPF鸡人工感染IBV-M41发病,采用Real-Time PCR方法跟踪检测其泄殖腔排毒情况;剖检并采集试验鸡的相关器官制作病理切片;在临床观察的基础上记录试验鸡的体质量、体温等指标。结果显示,所建立的检测方法重复性好,特异性高,最低可检测到28.3拷贝/μL的病毒核酸。人工感染病毒3～15 d后在鸡的排泄物中均检测到了病毒;攻毒组鸡临床症状明显,相关组织器官均呈现不同程度的病变。该病毒致病性试验、排毒规律和real-time PCR检测方法的建立,为IBV感染鸡作为实验动物模型进行相关药物的临床药效评价提供方法与依据。
2019年05期 v.39;No.269 842-847页 [查看摘要][在线阅读][下载 1449K] [下载次数：347 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 贾婧宇;凌珏怡;王志仙;王建业;朱国强;
为了了解鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)田间分离株是否存在变异可能,本研究对GPV分离株DY16进行了全基因组测序和重组分析。DY16株基因组由5 046个碱基组成,与国内外的5个强毒株同源性在98.1%以上。末端倒置重复(inverted terminal repeats,ITR)由414个碱基组成,与已报道的多个GPV强毒株同样在ITR的回文区茎部存在14个碱基对缺失。Simplot软件在DY16株VP1基因内部检测到2个重组信号,序列比对显示DY16株位于重组第1区域的10个和重组第2区域8个核苷酸位点分别与匈牙利的B株和国内弱毒疫苗株SYG61v相一致,而不同于先前的国内强毒株,但均未产生氨基酸改变。不同来源毒株在VP1基因内部重组对于GPV致病性的影响有待深入探究。
2019年05期 v.39;No.269 848-852页 [查看摘要][在线阅读][下载 1334K] [下载次数：301 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 马磊;曾繁文;丛锋;袁文;朱余军;伍妙梨;徐凤娇;黄碧洪;练月晓;黄韧;郭鹏举;
小鼠是科学研究中使用最多的实验动物,小鼠诺如病毒(MNV)是试验小鼠感染率最高的病毒性病原,因此MNV感染小鼠将影响研究结果,及时对小鼠健康状态进行监测必不可少。本研究根据逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA),通过引物探针的筛选,建立了检测MNV的RT-RPA方法。该方法具有较好的敏感性和特异性,通过荧光扩增曲线判定样本中是否含有MNV,在20 min内即可实现样本的检测。将该方法应用于临床样本的检测,结果显示32个样本中有6个阳性,和RT-qPCR检测结果总符合率达到97%。该方法的建立对于试验小鼠的日常病原监测和MNV流行病学研究具有重要意义。
2019年05期 v.39;No.269 853-859页 [查看摘要][在线阅读][下载 1747K] [下载次数：342 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 曾显成;陈珍珍;林心宇;程洁;张晨凯;刘平;池雪林;罗树红;修金生;
采用羊胚胎鼻甲(OFTu)细胞对湖北某山羊养殖场疑似羊口疮(Orf)的病羊唇部痂皮组织进行病毒分离,通过病理组织学、电镜形态观察及PCR试验等方法对分离的病毒进行鉴定,证实分离毒株为羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),命名为HuB13。分析HuB13 F1L基因序列,结果F1L基因全长为1 017 bp,编码339个氨基酸,G+C含量为64.70%。遗传进化树显示,HuB13与8株山羊和6株绵羊来源的ORFV同源性分别为97.50%～99.41%和97.15%～97.35%,与牛痘病毒(PCPV)和牛丘疹性皮炎病毒(BPSV)同源性分别为88.0%～88.69%和75.15%。Bioedit软件分析发现宿主为山羊和绵羊的ORFV存在1个高变异区(148～171 bp)和6个特异性位点G186C、T187G、A541G、A765G、G856A和G982A。研究结果为开发宿主特异的Orf疫苗及致病机理研究提供参考依据。
2019年05期 v.39;No.269 860-866页 [查看摘要][在线阅读][下载 3223K] [下载次数：362 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ] - 李家伟;王建科;张淑琴;张加力;郭利;
牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)是引起牛呼吸道疾病的一种病毒性病原体。本研究建立一种利用环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测BRSV的新的方法,针对BRSV N基因(GeneBank:AF054668.1)设计4对特异性LAMP引物,每组引物特异性识别靶基因序列上4个独立区域,利用扩增靶DNA的Bst2.0 DNA聚合酶,63℃恒温水浴50 min完成病毒检测,使用钙黄绿素检测荧光目视和琼脂糖凝胶电泳方法,同时对牛的其他主要病毒进行特异性检测,结果证明特异性好。该RT-LAMP检测方法的灵敏度达到BRSV模板稀释的10~(-6)倍,可成功检测到临床样本中的BRSV基因组,为BRSV的临床检测提供了一种快速的试验手段,更适合BRS的诊断和临床现场快速检测。
2019年05期 v.39;No.269 867-871页 [查看摘要][在线阅读][下载 762K] [下载次数：389 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：0 ] - 杨斌;徐仕忠;韦丁贤;袁天梅;王茂莹;岑秋丽;韦丽珍;潘夏雨;羊扬;朱国强;张伟;石宝兰;张建军;周玉双;
恶臭假单胞菌是一种广泛存在于环境中的人兽共患条件致病菌,主要引起水生动物疾病,其对禽类的致病性研究目前没有引起关注。本研究从临床上78日龄脚软病鸡的跖趾关节腔中分离出1株病原菌,结合临床症状、细菌培养和血清学凝集反应,前期一直怀疑为沙门菌,通过进一步的微生物质谱检测、生化反应和16S rDNA测序,确定为恶臭假单胞菌。药敏试验结果显示该分离株对头孢曲松、头孢他啶、庆大霉素、丁胺卡那、新霉素、四环素和环丙沙星7种受试抗菌药物敏感,对链霉素、青霉素、呋喃唑酮、磺胺异噁唑、氯霉素、氟苯尼考、林可霉素、红霉素、恩诺沙星、诺氟沙星10种受试抗菌药物均耐药。本研究首例报道从软脚病鸡临床分离到恶臭假单胞菌,对兽医临床鉴别诊断恶臭假单胞菌感染及临床防治用药具有指导意义和参考价值。
2019年05期 v.39;No.269 872-877页 [查看摘要][在线阅读][下载 1063K] [下载次数：307 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 张志强;杨楠;李永慧;苏硕青;李巧玲;段滇宁;吴同垒;钱爱东;史秋梅;
HtrA是一种重要的抗应激蛋白,对细菌抵抗应激条件至关重要。为研究HtrA蛋白在狐源大肠杆菌致病过程中的作用,本研究利用λ-Red同源重组方法构建狐大肠杆菌HtrA基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬细胞吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价,结果表明:与狐源大肠杆菌野生型菌株相比,HtrA基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本研究成功构建狐源大肠杆菌HtrA基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。
2019年05期 v.39;No.269 878-883页 [查看摘要][在线阅读][下载 510K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 余庆;陈小辉;崔亮亮;刘晓丽;张万坡;胡薛英;谷长勤;程国富;
旨在研究毒力蛋白SpiC在雏鸡肝组织内的动态分布及与肝脏损伤的关系。选用3日龄SPF雏鸡为试验对象,分别感染2株鸡白痢沙门菌(Salmonella pullorum,S.pullorum),并分别命名为S0701和S0702株。在进行致死性感染试验和半数致死量的测定后,建立动物感染模型。取肝脏于4%多聚甲醛中固定,并进行HE染色和毒力蛋白SpiC免疫组织化学染色。结果表明毒力蛋白SpiC主要分布于肝组织的巨噬细胞,肝窦内皮细胞及坏死灶内;毒力较强的S0701株感染雏鸡后肝脏中毒力蛋白SpiC的表达量高于S0702株。结果说明毒力蛋白SpiC与肝组织的损伤有关;毒力蛋白SpiC表达量与组织的损伤程度呈正相关,同时SpiC蛋白的表达量与菌株的毒力强弱呈正相关。
2019年05期 v.39;No.269 884-888页 [查看摘要][在线阅读][下载 2443K] [下载次数：145 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 郭慧琴;李田;肖鹏;余茂林;姜中其;
在金黄色葡萄球菌临床分离株耐药表型分析基础上,探索不同质量浓度木糖醇对该菌生物被膜形成的干预,旨在为耐药性研究及奶牛乳房炎治疗提供新思路。通过金黄色葡萄球菌专用显色培养基、PCR等方法分离鉴定金黄色葡萄球菌;按照K-B法测定临床分离株对17种常用抗菌药物的敏感性;采用刚果红平板试验、96孔板和置片法分析分离菌生物被膜形成能力;应用置片法、超声波洗脱结合平板计数考察不同质量浓度木糖醇对生物被膜形成黏附阶段的影响。结果显示:金黄色葡萄球菌的检出率较高达60.7%(236/389);分离株对青霉素、阿莫西林以及氨苄西林耐药率高达98.31%～99.58%,且均为多重耐药;刚果红试验结果表明,74.6%(176/236)的分离株能形成生物被膜;96孔板法发现分离株形成生物被膜能力按强、中、弱依次占34.7%(82/236)、51.6%(122/236)和13.6%(32/236);置片法提示培养4 d可得到成熟的金黄色葡萄球菌生物被膜;随机选取标准菌株ATCC29213和9株分离株(生物被膜形成能力强、中、弱各3株)发现,与不用木糖醇(2.28×10~5)相比,经0.125,0.250,0.500 g/mL的木糖醇处理后黏附到盖玻片上的菌落数(分别为1.51×10~5,1.37×10~5,1.10×10~5)分别降低了33.8%(P<0.01),39.9%(P<0.01)和51.8%(P<0.01)。由此推断:金黄色葡萄球菌临床分离菌株多重耐药严重,生物被膜形成普遍,0.125～0.500 g/mL的木糖醇能有效抵抗金黄色葡萄球菌黏附,从而干扰生物被膜的形成。
2019年05期 v.39;No.269 889-893页 [查看摘要][在线阅读][下载 1096K] [下载次数：579 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：23 ] |[阅读次数：0 ] - 钟杰;蔡宜冰;周瑶琴;徐作波;吴建云;丁红雷;
旨在筛选猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)部分血清体液免疫显性蛋白抗原。利用生物信息学软件筛选到7个普遍存在于Mhp菌株中的蛋白Mhp104、Mhp299、Mhp367、Mhp462、Mhp465、Mhp477、Mhp488。将其对应的基因分别连接pGEX-6P-1载体后转化至大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白。将诱导表达目的蛋白的7个重组菌裂解液和GST工程菌裂解液分别加入谷胱甘肽板进行抗原包被,以PBS+10%FBS+2.5%脱脂奶粉为封闭液,血清和酶标二抗分别按照1∶500,1∶40 000稀释,将抗原包被板分别与11份Mhp恢复期血清和7份Mhp阴性血清进行ELISA反应。结果表明,所有7个重组融合蛋白均能以可溶形式表达,且GST-Mhp299、GST-Mhp367、GST-Mhp488能被PreScission Protease酶切。最终共筛选出5个Mhp血清体液免疫显性蛋白抗原,分别为Mhp104、Mhp367、Mhp462、Mhp477、Mhp488,从而为Mhp基因工程亚单位疫苗的研发提供了抗原靶标。
2019年05期 v.39;No.269 894-900页 [查看摘要][在线阅读][下载 772K] [下载次数：158 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 张香斋;张召兴;李佩国;李蕴玉;贾青辉;张艳英;丁咚;
为了研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株真核表达载体pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2的免疫调节作用,将240只14日龄雏鸡随机分成8组,第1,2组分别为阳性、阴性对照,在14,21 d,3、4组分别肌注100μg的pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2;5、6、7组分别肌注50,100,150μg的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2;8组21 d时滴口免疫鸡球虫病四价活疫苗。28 d,阳性对照组和6个试验组每只鸡经口攻毒4×10~4个E.tenella卵囊,阴性对照组每只鸡灌服同体积的生理盐水。结果显示:当pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2真核表达载体的免疫剂量达100,150μg/只时,试验后7,21,28 d IgG的含量、7 d的IgA含量和21,28 d的IFN-γ含量均显著高于阴性对照组、阳性对照组、单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组(P<0.05);试验后28 d,血清中IL-2的含量显著高于阴性和阳性对照组(P<0.05),与单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组相比差异不显著(P>0.05);试验后7,14,21,28 d脾脏IL-2和IFN-γmRNA表达量均显著高于阳性对照组、单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组(P<0.05)。综上所述,IL-2可增强EtMIC-2基因的免疫原性,适量的真核表达载体pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2可显著提高感染柔嫩艾美尔球虫雏鸡的免疫功能。
2019年05期 v.39;No.269 901-906页 [查看摘要][在线阅读][下载 159K] [下载次数：87 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]
- 李红利;史书铭;关继羽;林静;孙诗惠;李姿;兰云刚;赵魁;贺文琦;高丰;宋德光;
VSV神经嗜性是该病毒作为活病毒疫苗载体广泛应用的最大障碍,因此研究VSV诱导神经细胞的损伤对深入探讨VSV嗜神经性的分子机制尤为重要。本研究通过直接免疫荧光检测,可见VSV感染N2a细胞呈细胞核碎裂、染色质致密浓染等细胞凋亡的形态学变化;Annexin-V FITC/PI流式细胞术检测表明,接种VSV 8 h后N2a细胞凋亡率接近50%;Western blot结果显示在VSV感染过程中,磷酸化AKT表达量降低,Bax表达量升高。上述结果表明,VSV可通过AKT/Bax信号通路诱导神经细胞凋亡。
2019年05期 v.39;No.269 907-911页 [查看摘要][在线阅读][下载 836K] [下载次数：205 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 王洪彬;朱利霞;吴同垒;任海;高桂生;张志强;史秋梅;靳晓敏;
为查明引起河北省昌黎县某海水养殖场半滑舌鳎患病及死亡的病原菌,本研究从半滑舌鳎肝、脾、腮、肠道分离纯化得到1株优势菌株,对其进行了理化鉴定和16S rDNA序列分析、致病性试验、毒力基因检测和中西药的药敏试验。结果显示,分离菌为创伤弧菌(V.vulnificus),序列比对显示与创伤弧菌同源性为100%,菌株命名为V.vulnificus QHD-1。动物回归试验证明该菌是半滑舌鳎的病原菌。小鼠半数致死量(LD_(50))为2.4×10~6 CFU/mL,携带毒力基因溶细胞素(vvhA)、细胞毒素(rtxA)、铁载体(viuB)、荚膜多糖(wza)等。西药药敏试验结果显示,分离菌株V.vulnificus QHD-1对氟苯尼考等7种药物敏感,对氧氟沙星等5种药物中敏;对头孢拉定、土霉素等6种药物耐药;中药药敏试验结果表明,苏木、诃子、乌梅、五倍子抑抑菌效果较好;最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)均为1.9～7.8 g/L;中药联合抑菌试验结果表明,黄芩和黄柏组合、五倍子和黄芩组合、乌梅和五倍子组合、艾叶和荆芥组合、板蓝根和黄芩组合对创伤弧菌表现协同作用。研究结果证明V.vulnificus QHD-1对鱼和小鼠具有较强的致病性,具有一定的公共卫生危害性;同时药敏试验结果为该地区鱼病的防治提供了依据。
2019年05期 v.39;No.269 912-918页 [查看摘要][在线阅读][下载 759K] [下载次数：392 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 潘耀谦;王选年;岳峰;李鹏;刘兴友;
为了调查兔脑炎原虫引起脑组织细胞的凋亡情况,本研究用特殊染色、TUNEL染色、凋亡蛋白免疫组化染色和Western blot,对40只家兔的脑组织进行了详细研究。结果表明,病兔的脑组织中均检出了肉芽肿和脑炎原虫。脑炎原虫所引起的脑细胞凋亡主要发生于脑血管的内皮细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞和上皮样细胞,其次为病变所累及的神经细胞。用TUNEL的免疫酶-荧光染色和抗凋亡蛋白的免疫组化染色,凋亡细胞均呈强阳性反应,被染成棕褐色。对脑组织蛋白提取物进行Western blot检测,病兔脑组织中P~(53)、Bcl-2、Bax和c-Myc凋亡基因蛋白表达量明显高于对照兔,差异非常显著(P<0.01)。结果表明,兔脑炎原虫在脑组织细胞内寄生时可以引起细胞凋亡。
2019年05期 v.39;No.269 919-924页 [查看摘要][在线阅读][下载 1724K] [下载次数：90 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 龚丽贞;宋肇程;陈欢;黄春芳;林霞琳;黄志坚;殷光文;
构建分子佐剂钙网蛋白Cal与弓形虫SAG1基因的真核表达载体,探讨其对小鼠的免疫原性。采用PCR扩增Cal和SAG1基因并将其克隆至Pvax1载体中,构建出重组质粒pVAX1-Cal-SAG1和pVAX1-SAG1。将构建质粒pVAX1-Cal-SAG1、pVAX1-SAG1同空载体pVAX1通过肌肉注射的方式免疫小鼠,通过ELISA、CCK-8法和小鼠攻虫试验对该DNA疫苗的免疫效果进行评价。结果显示:SAG1片段为855 bp,Cal-SAG1片段为1 566 bp,成功构建了真核表达质粒pVAX1-Cal-SAG1、pVAX1-SAG。小鼠免疫后pVAX1-Cal-SAG1诱导的特异性抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖反应和IL-4、IL-10、IL-12 p70及IFN-γ细胞因子水平均高于pVAX1组、pVAX1-SAG1和空白对照PBS组。攻虫后,佐剂组小鼠存活时间最长,较空白对照组多存活5 d。本研究表明:制备的重组核酸疫苗免疫小鼠后能够诱导机体产生体液和细胞免疫,分子佐剂Cal可以显著地增强弓形虫表面膜蛋白SAG1的免疫原性。
2019年05期 v.39;No.269 925-930页 [查看摘要][在线阅读][下载 641K] [下载次数：231 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 王春;张平平;赵勇;唐斌;刘晓雷;白雪;李仕存;刘明远;王学林;
基于上转发光免疫层析(UPT-LF)技术,旨在建立UPT-LF快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体的方法。采用间接法制备UPT-LF试纸条,通过共价偶联使二抗山羊抗猪IgG和上转发光纳米颗粒(UCP)结合,并加入样品垫和被检血清结合,以旋毛虫肌幼虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因(WM5)表达的蛋白WM5为猪抗旋毛虫IgG特异性结合抗原,WM5(2 g/L)与兔抗山羊IgG(0.5 g/L)喷点于分析膜上作为UPT-LF试纸条检测带(T)与质控带(C),该试纸条命名为Tsp-UPT-LF。Tsp-UPT-LF通过对95份阴性血清检测,确定Tsp-UPT-LF的Cutoff值为0.099。Tsp-UPT-LF和ELISA分别对273份旋毛虫感染猪血清样本进行检测,总符合率为92.31%,一致性系数Kappa(K)值为0.837,表明两种方法具有高度一致性。Tsp-UPT-LF检测旋毛虫、猪囊虫、华支睾吸虫感染的猪血清Tsp-UPT-LF呈现对旋毛虫良好的特异性。Tsp-UPT-LF检测感染50 000条旋毛虫肌幼虫28 d猪血清为阳性,T/C值0.109,122 d阳性最强,T/C值为0.207,至425 d时阳性值有所下降,抗旋毛虫IgG阳性率为71.4%。本研究建立了基于UPT-LF技术快速检测猪抗旋毛虫IgG抗体的方法,为猪旋毛虫即时感染检测、确保食品安全提供了一种可参考的检测方法。
2019年05期 v.39;No.269 931-935页 [查看摘要][在线阅读][下载 332K] [下载次数：238 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ]
- 张艳红;吴庆茹;师梦梦;王建;李光辉;袁梦琪;朱昱波;侯丽敏;杜新府;郭锋;
传染性法氏囊病毒(IBDV)感染造成病鸡法氏囊严重损伤,引起免疫抑制,然其具体机制仍不明晰。本研究旨在探讨IBDV感染对法氏囊表遗传修饰及其相关酶表达的影响。试验采用21日龄商品肉鸡,给予IBDV处理,感染后3,5 d收集法氏囊组织。应用基于ELISA试剂盒检测总5mC和m~6A,Real-time PCR检测相关催化酶基因表达。结果显示,感染后5 d,总m~6A水平及其甲基转移酶METTL3和METTL14 mRNA表达均显著降低(P<0.01);去甲基化酶FTO的表达在感染后3,5 d均显著降低(P<0.05)。总5mC水平在感染后3 d明显升高(P<0.05),其去甲基化酶Tet1 mRNA表达明显降低(P<0.01);感染后5 d,甲基转移酶DNMT1 mRNA表达显著降低(P<0.01),而DNMT3a的表达明显升高(P<0.01);结果表明IBDV能够影响法氏囊5mC和m~6A谱及相关酶的表达,这可能是IBDV影响宿主免疫功能的途径之一。
2019年05期 v.39;No.269 936-942页 [查看摘要][在线阅读][下载 1217K] [下载次数：194 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 朱光;吴小萍;周恩民;杜涛峰;
为研究姜黄素(curcumin)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)三者之间的关系,以高致病性PRRSV毒株GD-HD感染Marc-145细胞为研究对象,采用Western blot、病毒滴度测定和定量反转录PCR,分析姜黄素对PRRSV N蛋白和子代病毒滴度、HO-1 mRNA和蛋白表达水平的影响,并应用靶向HO-1特异性siRNA解析HO-1在PRRSV复制中的作用。结果显示,姜黄素呈浓度依赖性的抑制PRRSV N蛋白的表达水平和子代病毒滴度,同时增强HO-1 mRNA和蛋白的表达水平。用HO-1特异性siRNA敲低HO-1的表达可部分反转姜黄素的抑制作用。结果表明,姜黄素通过诱导HO-1的表达抑制PRRSV的复制。
2019年05期 v.39;No.269 943-947页 [查看摘要][在线阅读][下载 1041K] [下载次数：239 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 杨新宇;崔嘉;陈小风;吴峰洋;陈宝江;
旨在研究不同氨气质量浓度对小鼠肠道微生物多样性的影响。选取平均体质量为(23±2) g的KM小鼠90只,随机分为3个处理组,每组30个重复。分别饲养于3个独立的环境控制舱内,氨气平均质量浓度为0 (对照组)、20 (中质量浓度组)、50 mg/kg (高质量浓度组),于5,15,20 d取10只,颈椎脱臼处死后取肠道食糜,用Illumina-HiSeq高通量测序技术分析微生物群落结构。结果表明:处理组的α、β多样性、Shannon指数较对照组降低,表明不同质量浓度氨气处理对小鼠肠道微生物菌群多样性有一定影响;在门水平,处理组厚壁杆菌丰度增加,结合KEGG代谢途径分析,能量代谢通路可能发生了改变;Lefse分析筛选出氨气影响肠道健康的相关菌群有3种,分别是Blautia菌属、脱硫弧菌(Desulfovibrio,DSV)与慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae);通过KEGG代谢途径的差异分析,第5天时对照组和中质量浓度组与免疫相关的代谢通路存在显著差异。由此可见,氨气处理能显著影响小鼠肠道微生物菌群多样性,且提示氨气致肠道损伤与这些肠道菌群的变化密切相关。
2019年05期 v.39;No.269 948-955页 [查看摘要][在线阅读][下载 2978K] [下载次数：649 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：22 ] |[阅读次数：0 ] - 马维超;施晓杰;张倩;冯波;陈武;穆祥;
本试验旨在探究大肠杆菌热敏肠毒素处理(heat labile enterotoxin,LT)后,猪小肠黏膜微血管内皮细胞活力及细胞因子ET-1、IL-1β水平的变化。首先采用D-半乳糖凝胶树脂层析法提取猪E coli LT,利用SDS-PAGE验证蛋白纯度,并用Vero细胞检验提取物的生物学活性,最后采用CCK-8法检测LT对猪小肠黏膜微血管内皮细胞活力的剂量时间效应,ELISA法检测细胞培养上清中ET-1、IL-1β水平的变化。结果表明:所提蛋白为AB_5结构的LT,且具有良好的生物学活性;0.01 mg/L的提取蛋白作用3 h后便可显著降低小肠黏膜微血管内皮细胞的活性(P<0.05);作用细胞6 h后,0.01,0.1和10 mg/L LT组细胞培养上清中ET-1的含量显著升高(P<0.05),0.01和1 mg/LLT组IL-1β的含量显著升高(P<0.05)。结果表明,E coli LT可以显著改变猪小肠黏膜微血管内皮细胞的活力及细胞因子的表达。
2019年05期 v.39;No.269 956-961页 [查看摘要][在线阅读][下载 1246K] [下载次数：255 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 李铭;邹颖;郭寒;常仁旭;杨威;陈媛媛;夏成;张洪友;徐闯;张冰冰;
为探究NFκB-Orai1是否参与游离脂肪酸(NEFA)诱导的内质网应激,首先通过体外添加一定浓度的非酯化脂肪酸(nonestesterifiedfatty acid,NEFAs)(1.2 mmol/L)处理大鼠肝细胞不同时间,运用Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,测定NEFAs对内质网应激(ER stress)标志分子GRP78表达量以及钙通道相关蛋白Orai1表达水平的影响。结果显示NEFAs处理12 h时GRP78、Orai1表达量极显著高于对照组(P<0.01),证明12 h NEFAs刺激诱导产生内质网应激效果最佳。而后又通过分别添加NFκB抑制剂wogonin与Orai1抑制剂2APB,结果显示抑制NFκB和Orai1后NEFAs刺激可明显降低GRP78、NFκB p65、Orai1的表达水平。结果表明NFκB-Orai1参与NEFA诱导的内质网应激。
2019年05期 v.39;No.269 962-966页 [查看摘要][在线阅读][下载 980K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 高静雯;汪骁轩;魏殿华;高建鹏;章莲;张莉;齐亚银;
为了探讨较强寒冷刺激对阿勒泰羔羊血清IgG和皮质醇含量的影响及小肠黏膜免疫屏障的适应特征。把阿勒泰羔羊置于-30～-35℃分别进行0,6 h、1,4,12,24 d的冷刺激,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对阿勒泰羔羊血清中IgG和皮质醇的含量进行测定;通过石蜡切片和HE染色对阿勒泰羔羊小肠的显微结构进行观察;并通过改良甲苯胺蓝染色鉴定小肠中的甲苯胺蓝染色阳性细胞。发现冷应激后IgG质量浓度都比正常组明显降低,其中冷应激4 d与正常组质量浓度差异极显著(P<0.01),冷应激后皮质醇质量浓度比正常组表达上升,其中冷应激6 h时与正常组差异显著(P<0.05),而24 d与正常组差异极显著(P<0.01);IgG与皮质醇浓度在4,12和24 d呈较强正相关,6 h和1 d呈负相关,说明在强冷应激时,绵羊机体免疫机能的调节及抗炎症反应等受到了抑制。冷应激后十二指肠、空肠和回肠的显微结构发生了相应变化,其中最明显的是肠绒毛变短且变粗,回肠内淋巴小结数量增多;对小肠免疫相关细胞而言,同一温度下各肠段中细胞数量呈趋势变化,上皮内淋巴细胞和杯状细胞的数量在十二指肠、空肠和回肠中呈上升趋势,而肥大细胞数量呈下降趋势;冷应激后淋巴细胞数量较常温有所减少,杯状细胞和肥大细胞数量较常温下都有所增加,说明在强冷应激下机体通过激素的释放努力适应环境变化的同时,也会使小肠免疫功能下降。
2019年05期 v.39;No.269 967-974页 [查看摘要][在线阅读][下载 4788K] [下载次数：348 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：0 ] - 徐腾飞;张耀丹;李继红;汪伟;孟春春;孙英杰;谭磊;宋翠萍;廖瑛;丁铲;仇旭升;刁有祥;
APOBEC家族成员中AID蛋白具有DNA/RNA编辑酶功能,同时具有抑制病毒增殖的作用,但具体机制尚不明了。本研究首先根据NCBI公布的鸡全基因组序列进行生物信息学分析,预测鸡AID的基因序列并通过设计PCR引物,成功在鸡法氏囊cDNA样品中扩增出鸡AID基因(chAID)。通过建立并优化chAID的实时定量RT-PCR(rRT-PCR)检测方法,对鸡体内AID基因的表达以及其分布情况进行检测;同时通过Western blot试验对chAID蛋白在鸡细胞中的表达进行检测。试验显示,chAID基因能够在鸡细胞以及组织脏器中正常表达。新城疫病毒(NDV)感染鸡原代成纤维细胞、淋巴细胞后能够引起内源性chAID基因水平的上调;SPF鸡感染NDV后,chAID基因在不同组织脏器中均出现上调现象,以免疫器官最为显著。为了进一步验证chAID基因对NDV增殖的影响,进一步检测在细胞中过表达chAID基因对NDV增殖的影响。研究结果表明:重组chAID蛋白具有抗NDV病毒活性,本研究为进一步研究鸡chAID奠定了基础。
2019年05期 v.39;No.269 975-981页 [查看摘要][在线阅读][下载 1914K] [下载次数：96 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 邓欢;杨晶;刘金艳;石宝石;赖星;毛俊霞;唐志如;
旨在研究断奶仔猪肠道微生物氮代谢相关酶活对日粮粗蛋白(crude protein,CP)水平响应规律。选择54头体质量为(5.55±0.49) kg的28日龄杜洛克×长白×大约克断奶仔猪,采用单因子完全随机设计分配到CP为20%、17%、14%的3组日粮中,每组18个重复,每个重复1头猪。预试期7 d,正试期45 d。分别在正试期10,25及45 d,每组随机挑选6头进行屠宰,采集各肠段食糜和粪便样品分离微生物,测定肠道微生物氮代谢相关酶活力。结果表明,仔猪肠道微生物氮代谢相关酶酶活力具有肠段特异性,日粮高CP水平能显著提高肠道微生物硝酸还原酶(P<0.05)、腺苷脱氨酶(P<0.05)、谷氨酰胺合成酶(P<0.05)、尿素酶(P<0.05)、谷丙转氨酶(P<0.05)及蛋白酶(P<0.05)。肠道微生物的蛋氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸脱羧酶活力对日粮高CP水平响应明显(P<0.05)。消化道微生物氮代谢相关酶活力对蛋白质水平的响应规律性解析了当前猪蛋白质利用率低的原因。
2019年05期 v.39;No.269 982-989页 [查看摘要][在线阅读][下载 1551K] [下载次数：222 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 宋玉锡;白云龙;吴海洋;范子玲;夏成;张洪友;徐闯;
为了探究乏情奶牛同期发情处理前血浆生化指标的变化及对其输精后28 d妊检阴性(-)的风险预警意义,本试验在黑龙江省某集约化牛场选择了产后实施同期发情的奶牛共48头,根据试验奶牛产后40 d内是否发情分为发情组(E)23头和乏情组(A)25头,并对同期发情前试验牛进行血浆生化指标分析和输精后28 d妊检。结果显示:与发情奶牛相比,乏情奶牛血浆中孕酮(P_4)含量显著升高;雌二醇(E_2)、葡萄糖(Glu)、硒(Se)、牛组胺(HIS)、脑源性神经营养因子(BDNF)、牛组胺(HIS)含量显著降低。应用Pearson相关分析和二元Logistic回归模型确定了应用三针法前当奶牛血浆HIS含量> 26.12μg/L,输精后28 d妊检为阴性(-)的风险增大;应用五针前当奶牛血浆中E_2含量<46.45 pmol/L时,输精后28 d妊检为阴性(-)的风险增大。
2019年05期 v.39;No.269 990-995页 [查看摘要][在线阅读][下载 300K] [下载次数：130 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 郑家三;韦人月;夏成;徐闯;杨威;王洪斌;
为了早期预测奶牛腐蹄病的发生,在黑龙江某集约化牛场开展奶牛腐蹄病流行病学调查,检测患腐蹄病奶牛和健康奶牛血浆中的微量元素及维生素(Cu、Fe、Zn、VE、VH)、矿物质元素(Na、K、Ca、Mg、P)以及氧化应激指标(SOD、MDA、GSH-Px),阐明奶牛血浆微量元素及维生素、矿物质元素和氧化应激指标与腐蹄病的关系以及对腐蹄病发生风险的预警作用。结果表明:腐蹄病奶牛血浆Na、Mg、Zn、VE、VH、SOD和GSH-Px含量极显著降低(P<0.01),血浆K、Cu和MDA含量极显著升高(P<0.01)。Na、Mg、Zn、VE、SOD和GSH水平与奶牛腐蹄病呈显著正相关;血浆K、Cu、VH和MDA水平与腐蹄病发生呈显著负相关。根据受试者工作特征曲线(ROC)分析确定了该牛场的预警值为血浆Na<149.030 mmol/L、K>4.345 mmol/L、VE<14.390 mg/L、GSH<100.365 U/mL。结果显示,奶牛血浆Na、K、VE和GSH指标超过预警值可作为奶牛发生腐蹄病的早期风险预测依据。
2019年05期 v.39;No.269 996-1000页 [查看摘要][在线阅读][下载 311K] [下载次数：206 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 吴邦元;彭西;崔恒敏;
本研究采用显微组织学、超微组织学以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)等方法,研究了日粮中高水平氯化镍(NiCl_2)对雏鸡盲肠扁桃体的影响。结果表明,NiCl_2处理组与对照组相比,盲肠扁桃体发育受到明显抑制;淋巴滤泡内弥漫排列的淋巴细胞明显减少。超微结构和TUNEL检测发现,900 mg/kg处理组盲肠扁桃体凋亡细胞增多,淋巴细胞线粒体肿胀或空泡化,同时也观察到淋巴细胞核膜扩张。结果表明,日粮中NiCl_2水平超过300 mg/kg时,可抑制盲肠扁桃体的生长,引起组织结构和细胞器的损伤,提示过量NiCl_2可使盲肠扁桃体正常发育和功能受损,从而导致雏鸡消化系统黏膜免疫功能降低。
2019年05期 v.39;No.269 1001-1006+1013页 [查看摘要][在线阅读][下载 2095K] [下载次数：172 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]