预防兽医学

  • 非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性

    张艳艳;陈腾;张静远;齐宇;缪发明;薄宗义;王立冬;郭晓宇;周鑫韬;杨金梅;王晓虎;高玉龙;汪春雨;鲍晨沂;米立娟;孙雪霏;冯娜;杨金金;王承宇;万忠海;李记平;孟轲音;田多;李楠;王述超;王颖;张菲;张锦霞;蒋依倩;刘晔;张守峰;张中洋;钱莺娟;朱鸿飞;高玉伟;陈鸿军;李金祥;扈荣良;

    以我国首例非洲猪瘟疫情中分离的流行毒株(SY18)为亲本株构建了多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株,针对基因缺失株的安全性和免疫保护效果进行了特性研究。结果显示,MGF和CD2v双基因缺失株(ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v)对猪安全,接种猪能够100%抵抗亲本强毒株SY18株的攻击,对照猪全部死亡;说明该毒株可作为非洲猪瘟疫苗候选株。

    2019年08期 v.39;No.272 1421-1427页 [查看摘要][在线阅读][下载 885K]
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  • 利用杆状病毒表达系统表达PRV/gE蛋白及间接免疫荧光抗体(IDF)检测方法的建立

    朱和超;梁婉;范桂芳;彭忠;华琳;汤细彪;陈焕春;吴斌;

    为了建立高效灵敏的伪狂犬病病毒(PRV) gE蛋白的间接免疫荧光抗体诊断方法,本研究将PRV/HN/SMX/2012毒株gE蛋白的自身信号肽及胞外域片段克隆到pFastBacHT B载体上,构建重组质粒pFastBacHTB-gE,并转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经过3次蓝白斑筛选获得含有gE基因的重组杆粒rBacmid-gE。随后,将该杆粒转染至sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rAcMNPV-gE。经Western blot和间接免疫荧光实验(IFA)进行鉴定分析,发现重组gE蛋白在sf9细胞中表达。利用该sf9细胞建立检测血清中gE抗体的间接免疫荧光抗体(IDF)方法,通过反应条件的优化发现,将血清和羊抗猪FITC-IgG分别进行1∶40和1∶2 000稀释时所建立的方法能针对血清中gE抗体产生较强的特异性荧光;通过与商业化的ELISA检测gI/gE试剂盒(IDEXX)比较,所建立的检测方法与商业化试剂盒的总符合率为93.18%(164/176),阳性结果符合率93.75%(120/128),阴性结果符合率91.67%(44/48),2种方法存在很强的一致性(Kappa=0.832,CI=95%);-20℃条件下保存2个月的稳定性和重复性良好。

    2019年08期 v.39;No.272 1428-1434页 [查看摘要][在线阅读][下载 1664K]
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  • 猪伪狂犬病病毒变异株(Fujian-LY)人工感染小鼠动物模型的建立

    范克伟;何沙;林青青;郑琳;杨守深;刘建奎;林宏彬;宋洲洋;余佳;戴爱玲;杨小燕;

    为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)变异株人工感染小鼠动物模型,将本实验室分离鉴定的猪PRV变异株(Fujian-LY)进行连续10倍稀释后,对6周龄SPF级BALB/c小鼠进行腹股沟皮下接种攻毒,每个稀释度接种5只小鼠,测定其LD_(50),观测小鼠感染、致病的多项指标,试验期为7 d。结果显示,该毒株对小鼠的LD_(50)为3.7×10~3 TCID_(50)/0.1 mL,在不同的感染剂量下各攻毒组小鼠的临床症状、死亡率等各项指标差异明显,其中以2.3×10~5 TCID_(50)的攻毒剂量接种后小鼠未发生急性死亡,且能表现出以神经症状为主的典型伪狂犬病症状;病理剖检可见发病小鼠脑膜充血,肺脏出血,胸腺、脾脏严重萎缩等病理变化;病理组织学检查结果显示该毒株对攻毒小鼠全身多个重要组织器官均造成了严重的病理损伤,同时采用PCR及免疫组化的方法在这些组织内均能检测到PRV抗原。结果表明,本研究已成功建立了PRV变异株感染小鼠动物模型。

    2019年08期 v.39;No.272 1435-1440页 [查看摘要][在线阅读][下载 3298K]
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  • 基于DPO引物检测猪传染性胃肠炎病毒real-time RT-PCR方法的建立及应用

    王以欣;王紫微;王丽;姜艳平;崔文;周晗;乔薪瑗;唐丽杰;李一经;徐义刚;

    为建立快速、特异性检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的方法,以TGEV的N基因为靶基因,利用双启动寡核苷酸引物(dual priming oligonucleotide,DPO),建立了检测TGEV的real-time RT-PCR方法。结果显示,与常规引物相比,DPO引物的特异性强,有3个以上碱基与模板发生错配,将导致扩增效率极大降低或终止扩增反应,同时DPO引物有效退火温度范围较宽,在40~65℃均能高效地扩增靶基因,不需要对退火温度进行优化。本研究建立的方法灵敏度高,对TGEV核酸的最低检测限可达1.52×10~1 copies/μL,同时利用该方法对10种病毒株进行检测,仅TGEV为阳性,显示了良好的检测特异性。该方法的检测重复性好,以质粒标准品为模板的组内、组间重复性检测结果的变异系数均小于1.00%。利用建立的方法对采集的213份仔猪腹泻临床样品进行检测,共检出TGEV阳性样本31份,阳性率为14.55%,与常规RT-PCR方法检测结果的符合率为93.55%,与基于N基因测序结果的符合率为100.00%。本研究基于DPO引物建立的检测TGEV的real-time RT-PCR方法,为TGEV的准确检测和流行病学调查提供技术支持。

    2019年08期 v.39;No.272 1441-1447+1452页 [查看摘要][在线阅读][下载 3057K]
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  • 贵州省猪伪狂犬病的分子流行病学调查及变异分析

    胡玲玲;汤德元;曾智勇;王彬;黄涛;龙冬梅;石远菊;杨伟;叶丽;郭倩妤;廖少山;刘巧玲;

    为了解贵州省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的分子流行病学状况,本试验对贵州省16个规模化猪场2016-2017年间采集的1430份血液样品进行PRV gE/gB抗体ELISA和PCR检测,并对PCR检测呈阳性的部分样品进行gE基因的克隆、测序及分析。结果表明,共检出PRV gE抗体阳性样品27份,其中PRV在保育猪中的gB抗体阳性率为90.35%,相对保护力较为薄弱,野毒检出率最高;克隆测序得到的4株PRV gE基因序列中,株间核苷酸同源性为99.6%~99.9%,氨基酸同源性为99.1%~99.8%;遗传进化树分析得出检测毒株与GenBank上已公布的变异毒株序列同属一个较大而独立的分支。试验为了解和研究PRV贵州流行株的分子流行状况及变异特征提供一定的理论依据。

    2019年08期 v.39;No.272 1448-1452页 [查看摘要][在线阅读][下载 1528K]
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  • 1株QX基因型鸡传染性支气管炎病毒的致病性

    潘力;于可响;李桂明;刘存霞;李玉峰;杨世发;万仁忠;李智勇;赵增成;林树乾;

    通过对8日龄SPF鸡人工感染鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QX株发病,分别在攻毒后3,7,30 d剖杀并采集气管、肺、肾、脾、胸腺、法氏囊制作病理组织切片。攻毒7 d后,采集上述器官相同部位进行免疫组织化学法分析。根据IBV-QX株NP基因的保守序列设计引物,构建质粒标准品,建立了IBV-QX Real-time PCR标准曲线,并跟踪检测试验鸡的口腔、泄殖腔排毒情况。此外,观察并记录了2组鸡的临床症状、体质量差异等信息。结果显示,发病初期(3 d),气管、肺几乎无明显病理变化,其他器官均出现不同程度的炎性反应;临床症状明显期(7 d),所涉及的器官均有不同程度的病理变化;发病后期(30 d),气管纤毛有所恢复,肺、脾炎性反应有所减轻,但肾脏和法氏囊的病变依然严重。免疫组织化学法检测到上述器官均有可见抗原聚集。30 d时被感染鸡的口腔、泄殖腔仍可检出病毒核酸。试验鸡临床症状明显,体质量差异显著。本试验旨在探究具有组织嗜性的IBV-QX毒株对宿主的免疫器官和该病毒的主要靶器官的病理损伤以及被损伤器官的自我修复情况,抗原分布差异,排毒规律等,为后续研究宿主免疫器官发挥天然免疫的相关机理打下基础,也为研发新的疫苗、相关药物的临床药效评价、制定合理的疫苗接种策略提供参考。

    2019年08期 v.39;No.272 1453-1459+1465页 [查看摘要][在线阅读][下载 1852K]
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  • 基于恒定链载体不同抗原表位串联嵌合体免疫原性分析

    熊冉;艾珊珊;萧晟;

    为研究多抗原表位串联在恒定链(inviraint chain,Ii)功能片段载体增强免疫作用中的特性,自行设计一系列引物,克隆新城疫病毒HN和鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因片段,用连接序列将其串联,并进一步连接小鼠Ii功能片段Cyt/TM,构建HN/VP2、Cyt/TM/VP2、Cyt/TM/HN、Cyt/TM/HN/VP2和Cyt/TM/VP2/HN共5个嵌合体,定向插入pET-32a原核表达载体,转化大肠杆菌诱导表达并纯化融合蛋白,分别免疫小鼠,经间接ELISA法测定血清抗体效价。结果显示,Ii功能片段可增强小鼠分泌特异性抗体,无论是Ii功能片段连接单一抗原表位,还是Ii功能片段连接多抗原表位串联,均比单用抗原表位免疫组提高抗体效价3倍以上,而多抗原表位串联不同试验组之间差异不明显。结果表明,Ii功能片段(Cyt/TM)具有增强免疫的作用,其连接的抗原表位串联不影响其免疫原性。

    2019年08期 v.39;No.272 1460-1465页 [查看摘要][在线阅读][下载 1232K]
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  • 麻鸭源禽痘病毒的形态观察、分离鉴定及动物试验

    张红云;郑敏;罗满林;韦英益;孙文超;朱远致;辛佳亮;

    旨在对麻鸭源禽痘病毒进行分离鉴定,并对其组织嗜性和易感动物进行初步探索。用荧光定量PCR方法检测广西邕宁发病麻鸭皮肤痘疹样本,结果显示,呈鸭源禽痘病毒阳性;电镜观察负染标本和超薄切片,病毒粒子符合典型的痘病毒形态特征;HE染色镜检组织切片,符合痘病毒感染的病理学特征;利用SPF鸭胚和鸭胚成纤维细胞进行病毒分离,经IFA和PCR方法检测证实成功分离到1株麻鸭源禽痘病毒;对麻鸭15种组织597份样本进行检测,发现痘疹中病毒含量最高,其次为食管、喉头、气管,而在肠道和法氏囊中未检测到病毒;同居感染试验发现麻鸭、阳江鹅和樱桃谷鸭均可感染该病毒,而鸡和番鸭未见感染。结果为鸭源禽痘病毒的生物学特性、组织嗜性和宿主范围研究,以及其诊断和防控提供理论依据。

    2019年08期 v.39;No.272 1466-1471页 [查看摘要][在线阅读][下载 2494K]
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  • 2016-2017年我国蓝舌病病毒8型(BTV-8)血清学监测与分析

    朱沛;肖雷;朱建波;李华春;

    蓝舌病病毒(BTV)是一种重要的牛羊虫媒病毒,共有25个血清型,其中以BTV-8型危害最为严重。本试验通过对2016—2017年我国11个省63个地区的血清抗体水平的监测,分析目前我国BTV的流行情况及流行原因。结果显示,2年共调查14 953份血清,其中有2 748份为抗体阳性,平均阳性率为18.38%;被调查的省份均有BTV的流行,其中以广西、西藏、重庆3个地区的阳性率最高,分别为30.68%,29.04%,26.30%;以辽宁省的阳性率最低,阳性率为4.33%。细胞微量中和试验显示,所有BTV阳性血清中没有BTV-8型,可见BTV在中国的流行非常严重,但暂时未出现BTV-8型。本研究覆盖面广,样本量大,对我国多地区的牛羊进行了BTV的血清学调查,明确了蓝舌病在中国的分布及流行情况,为该病的防控提供了流行病学依据,为我国虫媒病毒的深入研究奠定基础。

    2019年08期 v.39;No.272 1472-1475页 [查看摘要][在线阅读][下载 1674K]
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  • 应用CRISPR/Cas9构建稳定表达CPV结构蛋白VP2的HEK293T细胞系

    骆茹梦;刘媛;朱记平;李毅;

    为了构建犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)结构蛋白VP2稳定表达的HEK293T细胞系,以2017年新分离的CPV-WH株为材料,扩增其VP2基因,并进行进化树分析。根据安全插入位点AAVS1位点序列设计sgRNA,并构建Cas9及sgRNA的表达载体PX335-U6-sgRNA-Cas9,同时构建含有VP2的特异性同源序列的片段HM-puro-eGFP-VP2-HA,将两者共转染HEK293T细胞后,通过嘌呤霉素筛选稳定表达VP2的HEK293T细胞株,并通过测序确定VP2正确插入。进化树分析显示CPV-WH的VP2存在S557N、T570K 2个氨基酸突变,该氨基酸位点可能与病毒免疫逃逸有关。通过荧光观察和免疫印迹确定了稳定表达细胞系中VP2的表达。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了表达CPV结构蛋白VP2的HEK293T细胞,为后期制备CPV样颗粒提供细胞模型。

    2019年08期 v.39;No.272 1476-1483页 [查看摘要][在线阅读][下载 2603K]
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  • 云南撒坝猪源大肠杆菌优势血清型强毒力岛的检测及其致病性

    刘超英;蒋欢;单春兰;高洪;严玉霖;富国文;赵汝;

    为研究撒坝猪大肠杆菌强毒力岛(HPI)的致病性,对撒坝猪致病性大肠杆菌进行了分离和血清型鉴定,获取优势血清型,采用PCR检测HPI,进行同源性比较,并通过耐药性试验和致病性试验对分离菌株与HPI的相关性进行分析。结果显示:分离得到101株大肠杆菌,确定血清型84株,其中O_3、O_4、O_(24)为优势血清型;HPI阳性率为88.64%,与GenBank登录的参考序列同源性比较大于99.3%;氨基糖苷类药物耐药性试验结果显示分离菌株普遍耐药,而HPI阳性株耐药性强,并检出含aac(3)-Ⅱa基因12株,含有aac(6′)-Ⅰb基因21株;致病性试验表明含irp2的菌株致病性强,而具有fyuA-irp2基因簇的菌株致病性更强。结果表明:HPI对大肠杆菌的毒力有增强作用。

    2019年08期 v.39;No.272 1484-1489页 [查看摘要][在线阅读][下载 1873K]
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  • 狐狸源小肠肠球菌分离鉴定与药敏试验

    吴同垒;鲁荣光;王洪彬;李巧玲;张志强;史秋梅;闫喜军;

    为确定某养殖场患病死亡狐狸的病原菌,本试验对病死狐狸进行剖检和细菌分离培养、生化鉴定以及16S rDNA鉴定、动物致病性试验和药敏试验。结果显示,分离菌株为革兰阳性球菌,经过生化鉴定和16S rDNA序列分析,确定分离菌株为小肠肠球菌,并命名为E.hirae QHD-1;动物回归试验结果显示,分离菌株E.hirae QHD-1对小鼠具有较强的致病性,LD_(50)为1.26×10~4 CFU;药敏试验结果显示,分离菌株E.hirae QHD-1对氨苄西林和恩诺沙星等药物敏感,对替米考星、阿米卡星等耐药;毒力因子检测结果显示,该分离株具有较强的致病力。毛皮动物小肠肠球菌的感染病例尚未见有报道,本试验丰富了狐狸病原菌相关的研究,并为防控该菌引起的疾病提供了重要参考资料。

    2019年08期 v.39;No.272 1490-1494+1499页 [查看摘要][在线阅读][下载 1677K]
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  • 狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株的构建及致病性

    张志强;苏硕青;杜万年;李永慧;吴同垒;史秋梅;朱国强;

    为研究YihE蛋白在狐肺炎大肠杆菌致病过程中的作用,利用λ-Red同源重组方法构建狐源大肠杆菌yihe基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果表明:与狐肺炎大肠杆菌野生型菌株相比,yihe基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力以及胞内存活能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本试验成功构建狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株,为研究YihE蛋白的作用机制奠定基础。

    2019年08期 v.39;No.272 1495-1499页 [查看摘要][在线阅读][下载 1595K]
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  • OEPR法构建mETX-mCPA表达质粒及其重组蛋白的免疫效果评价

    彭小兵;彭国瑞;李旭妮;董令赢;冯丽芳;蒋玉文;

    为了确定产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)和α毒素(CPA)无毒突变体作为亚单位疫苗同时预防D型和A型产气荚膜梭菌病的免疫效果,试验用点突变结合OEPR法构建重组质粒pET32a-mETX-mCPA。将阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,以预先添加乳糖的自诱导培养基表达目的蛋白。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白相对分子质量约为92 000,与预期值一致。Western blot检测结果表明,重组蛋白可被A型产气荚膜梭菌阳性血清所识别。致死性试验结果表明,重组蛋白不致死小鼠。以铝胶为佐剂将重组蛋白免疫家兔,二免血清0.1 mL可分别中和3个小鼠MLD的A型毒素和100个小鼠MLD的D型毒素。本研究用OEPR法成功构建了无毒突变体pET32a-mETX-mCPA质粒,获得的重组蛋白在家兔上显示出良好的免疫效果,为研发A、D型产气荚膜梭菌二价亚单位疫苗奠定理论基础。

    2019年08期 v.39;No.272 1500-1505页 [查看摘要][在线阅读][下载 1778K]
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人兽共患病

  • 裂谷热病毒eGn蛋白的制备及免疫原性验证

    韩秋雪;黄培;毕津豪;金宏丽;赵永坤;焦翠翠;张胜男;徐胜男;张颖;曹增国;迟航;王化磊;杨松涛;夏咸柱;

    通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrap~(TM)FF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。

    2019年08期 v.39;No.272 1506-1512页 [查看摘要][在线阅读][下载 2131K]
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  • 2017年国内大型鸡场分离的H9N2禽流感病毒的遗传进化和分子特征分析

    孙王杨吉;朱睿;张建军;石火英;

    H9N2禽流感病毒自1994年在广东首次报道暴发以来,已在国内广泛地流行,给养禽业带来了极大的损失,甚至威胁着人类的健康。为了解2017年国内H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化和分子特征变化,本研究从江苏、安徽、山东等地区的大型鸡场中分离到了10株H9N2亚型禽流感病毒。对10株分离株的基因分析表明,所有分离株均属于在2013年后占主导地位的G57型,由BJ/94系的HA、NA和NS基因,DK1系的PB2基因,F/98系的PB1,PA和NP基因以及G1/97系的M基因的四重组病毒组成,并且分离株的EID_(50)显著低于早期分离的H9N2禽流感病毒。10株分离株中有7株受体结合位点的198位发生了A到T,或者A到V的替换,并发生糖基化位点在218位的缺失,313位的增加。与近5年已经发表的流行株HA蛋白比较,所有分离株的抗原位点均发生了S127R、S183N、D216E、T220I、Q235M、S283R突变,NA基因在61~63位缺失NIT;表明分离株的抗原发生了变异。而分离株内部基因PB2上的K318R突变,PB1上的L13P突变,PA上的K356R突变、Q/T/S400P突变,NS上的E227K突变,NP上的D34S、K398Q突变,M1上的V15I突变以及M2上的I28V、L55F突变,使分离株更易感染哺乳动物,说明必需要继续加强H9N2禽流感病毒的监测,密切关注其对人类可能造成的影响。特别是10株分离株中首次出现的NA基因的E433D突变和PB2基因的E627V突变是否会给H9N2禽流感病毒增加新的生物学特性还有待进一步研究。

    2019年08期 v.39;No.272 1513-1525页 [查看摘要][在线阅读][下载 2763K]
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  • 河南省规模化猪场猪肠外致病性大肠杆菌的耐药性分析

    徐引弟;张青娴;王治方;朱文豪;焦文强;李海利;王克领;

    为探讨河南省规模化猪场猪肠外致病性大肠杆菌的耐药性及耐药基因的分布情况,设计了6大类药物24对引物,分别扩增猪肠外致病性大肠杆菌的24个耐药基因,对2017年1—12月从河南省猪场分离鉴定的52株猪肠外致病性大肠杆菌,进行了18种药物的药敏试验和24个耐药基因的扩增。结果表明,庆大霉素、卡那霉素、氨苄西林、阿米卡星、四环素、阿莫西林、复方新诺明、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素、新霉素、氧氟沙星和氟苯尼考耐药率较高,而头孢类耐药率最低。EFT+CAZ+CTX+CFP+CZ+AMX+AMP+OFL+ENR+CIP+GEN+KAN+AMK+TE+STR+NEO+SXT+FFC为最为流行的耐药型。β内酰胺类以blaTEM阳性率最高,氨基糖甙类strA基因阳性率最高,四环素类以tet(A)基因阳性率最高,喹诺酮类以gyrA基因阳性率最高,磺胺类以sul2基因阳性率最高。河南省猪肠外致病性大肠杆菌耐药十分严重,耐药机理复杂。

    2019年08期 v.39;No.272 1526-1532页 [查看摘要][在线阅读][下载 1693K]
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  • 布鲁菌分子标记菌壳株的构建与鉴定

    卜昭阳;钱晶;梁佳茗;王莉;屈海龙;王晓旭;杨艳玲;王秀然;闫广谋;郎需龙;王兴龙;

    旨在构建一种安全、高效的犬布鲁菌分子标记疫苗株。本试验将温控裂解部件(TLC)插入布鲁菌自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419中,构建温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC;通过电转化方式转入犬布鲁菌RM6/66感受态中,经卡那抗性和蔗糖培养基的正、负向筛选,将TLC片段定点插入布鲁菌B0419基因中,获得犬布鲁菌分子标记菌壳株。采用PCR法对连续30代次的菌株进行鉴定,结果显示裂解E基因和靶向插入位点区域(B0419基因)并未出现丢失和回复突变现象,表明该菌壳株具有良好的遗传稳定性。该菌壳株在培养至D_(600)值为0.6时,经42℃诱导60 h后,可获得裂解率达100%的犬布鲁菌菌壳;经超薄切片和染色处理后,在透射电镜观察下可见形态完整的空心结构,其内容物明显减少。本试验结合细菌菌壳技术与同源重组技术,成功构建了具有分子标记特征的犬布鲁菌菌壳株,为新型布鲁菌疫苗的研制提供策略。

    2019年08期 v.39;No.272 1533-1539页 [查看摘要][在线阅读][下载 2759K]
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  • 辽宁省规模化猪场生产链中沙门菌优势血清型及其主要毒力因子分布

    崔苗苗;刘全;董筱萍;刘静;刘英姿;高慎阳;周宇;张利勃;周铁忠;

    为了解辽宁省猪沙门菌流行菌株主要血清型毒力因子的分布特征及致病性,依据猪沙门菌属保守基因、多重PCR引物和血清凝集试验,从辽宁省选择有代表性的规模化养猪场、下游生猪屠宰场和肉类市场采集肠道、饲料和污水、猪肉等样品进行猪沙门菌及其血清型鉴定。应用猪沙门菌14种主要毒力因子特异性基因扩增检测方法,检测所分离到的不同血清类型猪链球菌的毒力因子分布情况,并应用小鼠攻毒试验和病理学技术对其致病性进行观察。结果显示:采集的412个样品中共分离到39株猪沙门菌,养猪场、屠宰场、销售市场所分离沙门菌检出率分别为51.28%,41.02%,7.70%;主要血清型为猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒型沙门菌,其阳性率分别为41.02%,38.46%,5.12%,未定型占15.38%;毒力因子共检出11种,其中检出率达到90%以上的和3种血清型共同携带的毒力因子结果一致有mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、stn,猪生产链3个环节共同携带的毒力因子有spvR、spvA、mogA、mgtC、araB、stn,其中养殖场毒力因子检出率最高,销售市场毒力因子检出率最低;猪霍乱沙门菌可引起小鼠的急性败血症,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌均可引起小鼠发病,但各器官的损伤则较轻。

    2019年08期 v.39;No.272 1540-1544+1565页 [查看摘要][在线阅读][下载 1929K]
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  • 维氏气单胞菌TH0426株ompW基因的克隆、生物信息学分析及其原核表达

    赵泽林;单晓枫;田磊;康元环;张冬星;田佳鑫;徐洋;钱爱东;

    为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)ompW基因的生物信息学特性及相关功能,试验克隆了维氏气单胞菌ompW基因片段,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级及三级结构,并对其进行原核表达及反应原性检测。结果显示,ompW基因全长594 bp,编码197个氨基酸,TH0426株ompW基因与A.veronii B5B6株属于同一分支;该蛋白属于外膜蛋白,在19~29位氨基酸之间有一个典型的疏水区域,不存在跨膜区、信号肽,二级结构以β折叠与无规则卷曲为主。Western blot结果显示OmpW重组蛋白能与鼠抗维氏气单胞菌(A.veronii)TH0426株血清发生特异性结合。综上,OmpW重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究A.veronii疫苗奠定基础。

    2019年08期 v.39;No.272 1545-1550页 [查看摘要][在线阅读][下载 2118K]
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  • 铱配合物对隐球菌性脑炎的靶向诊疗

    王庆华;付琛;侯伊雪;张华菁;付爱玲;

    旨在研究铱配合物对隐球菌具有高效杀菌作用,并显示脑靶向多肽引导的铱配合物可抑制脑部隐球菌生长,从而为隐球菌性脑炎的诊疗提供新的治疗思路。采用二倍稀释法检测最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),使用MTT法检测隐球菌活性。此外,通过枕骨大孔向脑膜腔内注射隐球菌,制备隐球菌性脑炎模型,然后静脉注射脑靶向多肽引导的铱配合物,评价铱配合物的诊断和治疗作用。结果显示,在将印度墨汁用于隐球菌诊断时,加入铱配合物后,在荧光显微镜下呈亮红色,能更清晰观察到匀浆中的隐球菌,从而可快速和准确地诊断出隐球菌感染。通过RDP多肽修饰的脂质体(RIrL)的脑靶向作用,铱配合物可迅速进入脑部并大量地积聚,达到杀菌的效果。与隐球菌性脑炎模型(平均存活时间为10 d)相比,靶向性铱配合物递药系统可使脑炎小鼠的平均存活时间延长到26 d。铱配合物的抑菌机制与其破坏了隐球菌细胞壁有关。结果表明,靶向性向脑内输送铱配合物的方法,将可能用于隐球菌脑炎的诊断和治疗。

    2019年08期 v.39;No.272 1551-1558页 [查看摘要][在线阅读][下载 2920K]
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基础兽医学

  • Orai1对NEFA诱导内质网应激引起犊牛肝细胞脂质沉积的影响

    王晶晶;李铭;温佳楠;朱星蕴;桑一凡;李颖;杨雅慧;李明洋;刘松;张冰冰;

    为探究Orai1是否参与非酯化脂肪酸(nonestesterifiedfatty acid,NEFAs)诱导内质网应激引起犊牛肝细胞脂质沉积,本试验首先通过体外添加高浓度NEFAs,运用Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,测定NEFAs对内质网应激标志分子GRP78表达量以及脂肪从头合成ACC1、FAS的表达水平的影响。而后又添加Orai1抑制剂2APB与RNA靶向沉默Orai1。结果显示,抑制或沉默Orai1后NEFAs刺激可明显降低GRP78、Orai1、ACC1、FAS的表达水平以及脂滴含量。结果表明,Orai1参与NEFA诱导的内质网应激引起犊牛肝细胞脂质沉积。

    2019年08期 v.39;No.272 1559-1565页 [查看摘要][在线阅读][下载 2899K]
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  • MPTP在庆大霉素诱导MDCK细胞线粒体凋亡途径中的作用

    杨汶菱;严磊;张绘艳;杨玲;刘宗平;顾建红;袁燕;卞建春;邹辉;刘学忠;

    为研究线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,MPTP)在庆大霉素(gentamicin,GM)诱导MDCK细胞线粒体凋亡中的作用,试验用4 mmol/L GM和2μmol/L抑制剂CsA(cyclosporin A,CsA)单独或联合处理MDCK细胞24 h,流式细胞术检测MPTP开放情况和细胞凋亡率;JC-1探针检测线粒体膜电位的变化;荧光检测线粒体变化;免疫印迹法检测Bax与Bcl-2表达量,Caspase-9、Caspase-3和PARP蛋白活化情况,Cyt C和AIF释放。结果显示,CsA能够显著或极显著抑制GM引起的MDCK细胞MPTP的开放,细胞凋亡率的上升,线粒体膜电位下降,Bcl-2/Bax比值下降,Caspase-9、Caspase-3和PARP蛋白的活化以及Cyt C与AIF的释放(P<0.05或P<0.01);说明MPTP正向调节GM引起的MDCK线粒体凋亡。

    2019年08期 v.39;No.272 1566-1570+1576页 [查看摘要][在线阅读][下载 2688K]
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  • 循环式吸入麻醉装置的制作及其对大鼠麻醉效果

    张肇南;童津津;许倩;邱晓彤;刘沣莹;许嘉辉;张华;

    设计并制作1台用于大鼠的循环式吸入麻醉装置,并对大鼠的麻醉效果进行手术验证。利用CDR绘图软件设计麻醉装置样图,然后收集所需材料根据设计样图组装吸入麻醉装置。随机选取10只SD大鼠,使用本装置将其麻醉进行常规手术(开腹探查和胃切开术),术中记录麻醉各个阶段的时间,并用生理监测仪连续动态监测大鼠呼吸(RR)、心率(HR)、血氧(SpO_2)、收缩压(SBP)、平均动脉压(MAP)和体温(t),同时观察大鼠镇静、镇痛和肌松效果,以评价麻醉装置的安全性和可用性。根据设计样图完成了吸入麻醉装置的连接和组装。用该装置对大鼠麻醉诱导的时间为(2.20±0.45) min,达到外科麻醉所需时间为(2.12±0.36) min,麻醉维持和苏醒时间分别为(45.18±0.12),(2.40±0.55) min,麻醉总时间为(51.40±0.24) min。术中大鼠镇静、镇痛、肌松弛效果良好,在手术后10,20,30,45 min时HR、SpO_2、RR、T、SBP、MAP均保持平稳,各项生理指标在每个时间点都无显著性差异(P>0.05)。该吸入麻醉装置对大鼠麻醉效果确实、安全可控,麻醉诱导和苏醒时间较快,可完全满足手术对麻醉的要求。

    2019年08期 v.39;No.272 1571-1576页 [查看摘要][在线阅读][下载 2555K]
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临床兽医学

  • 仔猪吃初乳前后血清差异蛋白的鉴定和分析

    徐守兴;卢炳州;刘华南;王国庆;吴斌;张克山;郑海学;刘湘涛;

    通过SDS-PAGE方法对仔猪吃初乳前后血清进行检测,找到差异蛋白后,利用LC-MS/MS技术对差异蛋白条带进行鉴定,并使用生物信息学手段对鉴定的蛋白进行GO和KEGG分析。结果显示,仔猪吃初乳前后有很明显的差异蛋白条带,共鉴定出338个蛋白,GO和KEGG分析结果表明,差异蛋白的功能主要和生长发育和免疫保护相关。这为进一步研究初乳调控仔猪生长发育和免疫调控奠定基础。

    2019年08期 v.39;No.272 1577-1580+1590页 [查看摘要][在线阅读][下载 2226K]
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  • L-酪氨酸对泰和乌骨鸡十二指肠亲银细胞的影响

    曾杰;肖红;温泽星;钟圣伟;戈婷婷;周作红;张晖;

    泰和乌骨鸡是一种具有较高经济价值的家禽,其最大的特点是机体内有过度沉积的黑色素,但其生理学机制并未完全阐明。L-酪氨酸是合成黑色素的底物,也是亲银细胞合成儿茶酚胺的底物。然而L-酪氨酸与亲银细胞的相关性并不清楚。本试验通过在泰和乌骨鸡饲粮中添加不同浓度的L-酪氨酸,饲喂4周后,使用光镜技术和Masson-Fontana氏亲银组织化学染色法检测十二指肠亲银细胞的变化情况。结果表明,在泰和乌骨鸡饲粮中添加0.0%~0.8%的L-酪氨酸可促进亲银细胞数量的增加。结果提示,增加的亲银细胞可合成和分泌5-羟色胺和儿茶酚胺,这些物质可作为黑色素合成的前体物质,进而促进黑色素生成增加。

    2019年08期 v.39;No.272 1581-1585页 [查看摘要][在线阅读][下载 2845K]
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  • 奶牛低血钙症降低中性粒细胞上ORAI1蛋白的表达

    郭寒;杨威;陈媛媛;夏成;张洪友;徐闯;张冰冰;

    旨在研究泌乳初期高产奶牛高发的低血钙症是否影响细胞内Ca~(2+)通路进而影响中性粒细胞活性并增加泌乳初期的炎症反应。尾静脉肝素抗凝采集血液分离中性粒细胞(PMN),采用Western blot检测ORAI1蛋白的表达,利用流式细胞仪测定静息状态下、离子霉素刺激的中性粒细胞表面ORAI1蛋白丰度以及ROS水平。结果显示,健康对照组奶牛中性粒细胞表面ORAI1蛋白丰度与表达水平均显著高于低血钙症试验组。低血钙症中性粒细胞经离子霉素刺激后细胞表面ORAI1蛋白丰度显著高于未经刺激的低血钙症PMN。健康对照组奶牛中性粒细胞中的ROS水平显著低于低血钙症试验组。这些结果表明,奶牛低血钙症降低中性粒细胞内钙离子进入的调控,以及低血钙症能降低中性粒细胞内的ROS水平,导致泌乳初期的炎症反应。

    2019年08期 v.39;No.272 1586-1590页 [查看摘要][在线阅读][下载 2385K]
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  • 玉米蛋白水解物对Wistar大鼠生长性能和血液代谢物的影响

    姜鑫;刘鑫;么恩悦;赵洪波;张永根;

    为探讨玉米蛋白水解物(CPH)对大鼠生长性能和血液代谢物的影响,试验选用体质量相近Wistar大鼠60只,按CPH添加剂量随机分为5组,每组12个重复。5组分别为对照组(0 g/kg)和4个不同CPH剂量组(0.2,0.4,0.8,1.6 g/kg),对大鼠进行连续28 d灌胃试验。结果显示:添加不同剂量CPH显著提高了大鼠平均日增体质量,脾脏、胸腺和肝脏指数(P<0.05);与对照组相比,试验组显著提高了大鼠血清中葡萄糖含量,降低了尿素氮含量(P<0.05);添加CPH显著提高了大鼠血清中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,提高了还原性谷胱甘肽含量(P<0.05),并且显著提高了血清中免疫球蛋白A、G和M含量(P<0.05),同时还显著提高了血清中类胰岛素生长因子-Ⅰ、生长激素和甲状腺激素含量(P<0.05)。由此可见,CPH可以提高Wistar大鼠生长性能,改善血清生化和激素指标,提高大鼠免疫和抗氧化能力,其中以0.8 g/kg剂量为宜。

    2019年08期 v.39;No.272 1591-1595+1608页 [查看摘要][在线阅读][下载 1910K]
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动物科学

  • 利用微卫星标记进行猪亲子鉴定

    谢苏;沈永巧;陈焱森;黄涛;

    以杜洛克猪、长白猪、大白猪3个品种的48头系谱清楚的猪为样本,使用PAGE法从55个微卫星位点中筛选出扩增效果好、多态性丰富且便于进行多重PCR扩增的位点,对试验样本逐一进行基因分型,并据此进行亲权确认,建立一种高效的亲子鉴定方法。结果显示,试验选取的14个微卫星位点在48个样本中进行排父率分析,在双亲未知、只知单亲和双亲已知的情况下计算的累积排父率分别为0.978 5,0.998 4,0.999 99;利用建立的亲子鉴定体系对样本中8个家系进行检测,结果累积排父率均大于99.99%。结果表明,试验构建的微卫星标记体系,为亲本信息不明的个体进行亲子关系的验证,纠正潜在的错误系谱,建立完整、准确的系谱体系,保证育种值估计的准确性,保障猪育种工作的正常开展具有非常重要的意义。

    2019年08期 v.39;No.272 1596-1603页 [查看摘要][在线阅读][下载 2099K]
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  • 奶牛ADRP基因超表达细胞株的建立及对细胞脂滴的影响

    庞坤;朱松波;常磊;孙娅莉;韩立强;

    通过PCR方法扩增奶牛脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation-related protein,ADRP)基因的编码区,构建Lenti-ADRP慢病毒重组载体,包装成病毒后感染奶牛乳腺上皮细胞,通过嘌呤霉素筛选获得超表达ADRP细胞株,采用Real-time PCR和Western blot分析细胞株中ADRP基因和蛋白的表达情况;采用尼罗红对脂滴染色,分析ADRP超表达对细胞脂滴的影响。结果显示,克隆的ADRP基因CDS区序列大约1 353 bp,成功构建重组的ADRP慢病毒载体,用5 mg/L嘌呤霉素筛选得到ADRP超表达乳腺上皮细胞株;与对照组细胞相比,超表达细胞株的ADRP基因mRNA水平增加632倍(P<0.001),蛋白表达也有所增加;检测脂滴的荧光值发现,ADRP超表达显著增加了细胞脂滴含量(P<0.01)。结果表明,超表达ADRP可促进乳腺上皮细胞的脂滴合成。

    2019年08期 v.39;No.272 1604-1608页 [查看摘要][在线阅读][下载 2135K]
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  • 牦牛miR-381的靶基因预测及生物信息学分析

    周学兰;吴晓云;梁春年;郭宪;丁学智;褚敏;王宏博;裴杰;包鹏甲;阎萍;

    旨在对牦牛miR-381的靶基因进行预测和生物信息学分析,探索其影响牦牛肌肉发育的作用机制。将高通量测序获得的牦牛miR-381序列与miRbase数据库中已有物种miR-381成熟序列的保守性进行比对分析,利用TargetScan、miRDB和miRanda对miR-381靶基因进行预测,交集的基因与miRTarbase数据库中已证实的靶基因合并后进行基因本体论富集和信号通路富集分析。结果显示,miR-381序列在各物种间高度保守,其靶基因主要参与转录调控过程、横纹肌发育的负调节、细胞周期、心脏发育、肌肉收缩和细胞增殖等生物学过程。信号通路分析结果显示靶基因显著富集于Wnt、TGF-β、MAPK和Notch信号通路等与肌肉发育相关的通路中。由此推测,miR-381可能通过抑制Wnt、MAPK和TGF-β等信号通路的靶基因,进而调控牦牛骨骼肌的发育。研究结果将为进一步探讨miR-381在牦牛肌肉发育中的作用奠定理论基础,同时也为解析牦牛肌肉发育的分子机制提供新的思路。

    2019年08期 v.39;No.272 1609-1615页 [查看摘要][在线阅读][下载 2371K]
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  • 牦牛成纤维细胞敲低HO-1基因后对相关基因表达的影响

    杜嘉祥;张全伟;王琪;张勇;马友记;赵兴绪;

    血红素加氧酶1(heme oxygenase1,HO-1),是血红素分解代谢过程中的限速酶,起到重要的抗氧化损伤作用,HO-1活性的改变直接影响抗氧化损伤能力的变化。为研究HO-1基因在牦牛高海拔低氧适应的氧化损伤功能,通过构建HO-1基因的siRNA序列,转染牦牛胎儿成纤维细胞,试验前期发现HO-1基因过表达后与CYGB(胞红蛋白)、eNOS(内皮型一氧化氮合酶)基因相关。通过qRT-PCR和蛋白免疫印记(Western blot)检测转染HO-1 siRNA序列的牦牛成纤维细胞在正常条件和低氧条件(5%氧气)下0,24,48,72 h相关基因和蛋白表达变化。结果显示:siRNA转染牦牛成纤维细胞后,试验组HO-1的表达量显著低于空白组和阴性组(P<0.01),试验组CYGB表达量也低于空白组和阴性组(P<0.01),且HO-1、CYGB蛋白表达量在72 h最低,试验组eNOS mRNA表达量显著低于空白组和阴性组,eNOS蛋白未见表达。结果揭示:牦牛成纤维细胞敲低HO-1基因后,HO-1基因和蛋白表达量明显下调,且对携氧蛋白CYGB及eNOS信号通路的表达具有相同的影响。该结果为牦牛HO-1的功能及其在牦牛缺氧保护机制的研究提供理论依据。

    2019年08期 v.39;No.272 1616-1621页 [查看摘要][在线阅读][下载 2313K]
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  • 抗凋亡蛋白cFLIP在山羊妊娠黄体中的表达

    王延莉;娄安钢;金花子;金海国;

    为研究山羊妊娠黄体中抗凋亡蛋白,即细胞FLICE样抑制蛋白(cellular FLICE-Like inhibitory protein,cFLIP)的表达,分析探讨cFLIP在维持山羊正常妊娠黄体中的作用。试验收集山羊不同妊娠阶段(19,31,92,142 d)的黄体组织,分别采用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学分析等方法,以确定cFLIP免疫定位,检测cFLIP mRNA及其蛋白在山羊不同妊娠阶段黄体中的表达水平;分别以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA和β-肌动蛋白(β-actin)作为内在对照。结果显示,cFLIP短链(cFLIP_S)和cFLIP长链(cFLIP_L)的mRNA及cFLIP_S蛋白在妊娠期各阶段的表达水平无显著性差异(P>0.05),而妊娠31d的cFLIP_L蛋白的表达水平却显著低于其他妊娠组(P<0.05);免疫染色结果显示,cFLIP蛋白的阳性反应在山羊妊娠不同阶段的黄体中均有高度表达;在妊娠19,92,142 d的黄体中均有观察到PCNA阳性,在妊娠31 d发现PCNA阳性较微弱;并且在所有妊娠组黄体中,几乎观察不到细胞凋亡(TUNEL阳性)。因此,推测cFLIP作为一种生存因子,参与维持山羊正常妊娠,其在妊娠黄体组织中的高水平表达可能在维持山羊正常妊娠中发挥抗凋亡作用。

    2019年08期 v.39;No.272 1622-1627+1634页 [查看摘要][在线阅读][下载 3345K]
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  • 绵羊卵泡期卵泡颗粒细胞FSHR差异剪接体的表达

    郭云霞;郝庆红;张英杰;刘月琴;

    为探讨卵泡期卵泡颗粒细胞促卵泡素特异性受体(FSHR)差异剪接体表达的变化,选择30只道寒杂交一代育成母羊肌注PG+埋植CIDR+肌注PG进行同期发情处理,选取9只发情母羊屠宰,取两侧卵巢组织,按小卵泡(≤3.0 mm),中等卵泡(3.0~5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)级别分别收集卵泡液和颗粒细胞,采用放射性免疫法测定类固醇激素(E_2和P_4)和FSH浓度,实时定量PCR检测不同直径卵泡颗粒细胞FSHR差异剪接体表达水平。结果表明,小卵泡和中等卵泡中FSHR1和FSHR3 mRNA的表达量极显著高于FSHR2和FSHR4(P<0.01),在中等卵泡中FSHR3 mRNA的表达量显著高于FSHR1(P<0.01);大卵泡中FSHR2 mRNA的表达量显著高于FSHR1、FSHR3和FSHR4(P<0.01),FSHR1、FSHR3和FSHR4 mRNA的表达量差异不显著(P>0.05)。大卵泡中雌激素浓度极显著高于小卵泡和中等卵泡(P<0.01),孕酮浓度无显著性差异(P>0.05),E_2/P_4比值与大卵泡中FSHR3 mRNA的表达量呈极显著负相关(P<0.01)。由结果可知,卵泡发育过程中FSHR1和FSHR3可能是小卵泡和中等卵泡颗粒细胞增殖的2种主要剪接形式。

    2019年08期 v.39;No.272 1628-1634页 [查看摘要][在线阅读][下载 2505K]
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综述

  • 抗猪流行性腹泻病毒制剂研究进展

    王艳丰;张丁华;朱金凤;常洪涛;张战军;陈付梅;

    <正>猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的一种急性肠道传染病。PEDV属于α冠状病毒,单股正链RNA病毒,分别编码4个结构蛋白,即纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N),以及15个非结构蛋白(Nsp1-Nsp15)和ORF3~([1])。PEDV靶向

    2019年08期 v.39;No.272 1635-1641页 [查看摘要][在线阅读][下载 2047K]
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  • MDV一种疱疹病毒诱导宿主细胞转化的模型

    王宜平;张佩琪;李真诚;岑美珍;纪春晓;

    <正>马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV )是引起鸡T淋巴细胞致瘤的α疱疹病毒,该病毒导致一种致瘤性和免疫抑制性禽病,称为马立克病(MD)。已发现的MDV有3种血清型,Ⅰ型为致瘤性的MDV强毒株,Ⅱ型为无致瘤性的MDV毒株,Ⅲ型为火鸡疱疹病毒(简称HVT)。HVT与MDV有明显区别,对鸡无致病性,广泛用于预防MD的活疫苗。近年来,MDV的致瘤基因在疫苗的防御机制下逐渐出现多态性变化和点突变变化~([1]),从而

    2019年08期 v.39;No.272 1642-1646页 [查看摘要][在线阅读][下载 2002K]
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  • 细菌自转运蛋白主要功能与应用研究进展

    冯腾;李攀;赵光夫;李能章;彭远义;

    <正>革兰阴性菌具有外膜和内膜2层脂质双分子层,其分泌系统较革兰阳性菌更为复杂多样,而其中V型分泌系统是其中结构最简单的一种。V型分泌系统所转运的蛋白质统称为自转运蛋白(autotransporter)。自转运蛋白是在革兰阴性菌中广泛存在的一类蛋白质,它通常作为细菌的外膜蛋白或者分泌蛋白在细菌的多种生命活动中发挥着重要的作用,尤其是在一些动物共生菌或致病菌中,这些细菌在与宿主体内环境的长期共同进化中,分化出多种功能的自转运蛋白,使其能够更加适应体内的环境。

    2019年08期 v.39;No.272 1647-1652页 [查看摘要][在线阅读][下载 2075K]
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