- 郭振华;阮海宇;李翔;张改平;
为了解河南省引起仔猪腹泻的猪肠道冠状病毒的感染和流行情况,我们对2017年度发生仔猪腹泻的河南省25家养殖场送检的94份仔猪肠道或粪便样品开展了相关检测。结果显示猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhoea virus,PEDV)的样品检出率为68.1%(64/94),猪场阳性率为76.0%(19/25),但未检测到猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDcoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。为进一步分析PEDV的遗传变异情况,利用RT-PCR和基因克隆测序技术,我们成功获得了8株PEDV的S1基因片段的核苷酸序列。分子进化树分析显示,我国流行毒株可以分为G1a(疫苗及其衍生株)、G1b(经典毒株)、G2a(2011-2013年变异株)、G2b(2016-2017年变异株)和G2c(重组毒株)5个进化分支,本研究获得的S1基因序列均处于G2b进化分支,且与2016-2017年间的流行毒株遗传距离更近。同源性分析显示,8株分离株彼此之间S1基因片段的核苷酸同源性为97.3%～99.5%,与变异毒株AJ1102的同源性为97.2%～98.0%,而与经典毒株CV777、CH/S的同源性仅为91.0%～92.3%。氨基酸序列比对分析显示,与CV777和CH/S等经典毒株相比,分离株S1基因片段除了多个氨基酸位点发生变异外,在~(58)NQGV~(61)、~(140)N、~(157)H这3个位置有氨基酸的插入,在~(163)NI~(164 )有2个氨基酸的缺失,这与之前关于PEDV变异株的研究报道相一致。此外,与其他变异株相比,本研究发现分离株HeNPDS/2017在491位有1个新的丝氨酸(Ser)缺失位点,其生物学意义有待进一步研究。本研究丰富了PEDV的分子流行病学数据,有助于了解河南省PEDV流行和遗传变异的最新情况,为该地区猪流行性腹泻病的防控提供一定的参考。
2020年01期 v.40;No.277 1-8页 [查看摘要][在线阅读][下载 3029K] [下载次数：199 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 赵宇;崔建涛;田润博;韩昊莹;郑慧华;刘芳;陈红英;
为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。
2020年01期 v.40;No.277 9-13页 [查看摘要][在线阅读][下载 434K] [下载次数：182 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 师乾凯;张增贤;贾敬亮;张迪;管朔;侯林杉;范京惠;左玉柱;
为了解猪圆环病毒型(porcine circovirus3,PCV3)在河北省的流行情况及遗传变异特点,本研究在2017年2月至2018年7月间,从河北省不同地区60个猪场采集了310份不同临床症状表现的发病猪组织样本,应用PCR方法对其进行检测。结果显示该地区PCV3阳性率为16.5%(51/310),猪场阳性率为45.0%(27/60),对不同临床症状发病率分析显示PCV3在表现为繁殖障碍及腹泻猪群中具有较高的阳性率,且易与PCV2发生共同感染。对获得的8株PCV3的cap基因进行测序及同源性分析显示,所得8条序列之间的核苷酸相似性为98.0%～99.7%,与24条国内外参考株之间的核苷酸相似性为98.0%～100.0%。对cap基因所推导的氨基酸序列进行分析发现cap基因的主要突变位点发生在24,27,77及150位,其中24和27位主要发生了A24V和R27K变异。对32条序列进行进化树的构建发现,进化树可分为3a、3b和3c 3个基因群,河北分离株主要分布于3a基因群和3c基因群,表明了河北省PCV3流行株相对稳定。我们的研究结果为PCV3在河北省的流行及进化特点提供了理论参考,这些数据可为该地区PCV3的诊断及综合防控提供科学依据。
2020年01期 v.40;No.277 14-19+27页 [查看摘要][在线阅读][下载 2902K] [下载次数：253 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：19 ] |[阅读次数：0 ] - 武鑫宇;李姿;石俊超;胡诗雨;刘蕾;刘晓东;赵魁;高丰;贺文琦;
猪的冠状病毒感染对于生猪养殖的危害性受到高度关注,其发病原因复杂多样,使得该类疫病的临床鉴别诊断成为一大难点。猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)为3种常见的仔猪易感冠状病毒,对幼龄仔猪的致死率较高。本研究选取上述3种病毒核(N)蛋白进行原核表达与纯化,并将其固定至芯片载体上,经反应体系优化,制备了一种可同时检测上述3种病原特异性抗体的可视化蛋白芯片。将其初步应用于临床检测,结果表明,该标准化蛋白质芯片特异性、敏感性良好,最低检测限为稀释12 800倍,与ELISA的符合率在90%之上。本研究制备的可视化抗体芯片,能够迅速、高效、大量地对猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪血凝性脑脊髓炎进行类症鉴别诊断,并有望应用于临床门诊及基层养殖场中PEDV、TGEV、PHEV 3种病原特异性抗体水平监测。
2020年01期 v.40;No.277 20-27页 [查看摘要][在线阅读][下载 2362K] [下载次数：209 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 刘晓东;连世存;刘丰波;马振乾;刘红详;董雅琴;高丰;
为了更好得了解我国猪场猪繁殖与呼吸道综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)免疫水平,本试验利用ELISA方法对2015-2017年国内2 012个猪场PRRSV抗体进行监测,结果发现2015-2017年平均抗体阳性率逐年升高,由2015的75.6%逐步升至2017年的81.3%,根据不同区域检测发现2015-2017年3年抗体阳性率平均值华东地区最高82.9%,西南最低74.1%;不同阶段猪群抗体阳性率检测显示种猪群抗体阳性率最高3年内的阳性率在83.7%～87.6%之间;对2015-2017年不同分布区间抗体比例显示:S/P值主要分布于:0.4～2.0区间内,但小于0.4的区间比例次之,大于3.5区间比例最小。由此可以推测随着养殖场对PRRS的重视,我国整体对其防控水平也在逐年提高。
2020年01期 v.40;No.277 28-31页 [查看摘要][在线阅读][下载 113K] [下载次数：141 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 张森;石远菊;汤德元;王彬;郭倩妤;廖少山;杨志刚;
根据GenBank中PRRSV ORF6、PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、SIV M、JEV NS1、CSFV E2等基因的部分片段,分别设计特异性引物,用实验室已保存的病毒及阳性病料,通过对7个病毒单一PCR的退火温度和敏感性进行优化和检测,再选择合适的多重PCR缓冲体系及酶,优化退火温度、模板及引物浓度,最后检测多重PCR的敏感性、特异性及重复性,建立一种能够同时且快速鉴别PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV这7种常见猪呼吸道和繁殖障碍类病毒的多重PCR检测方法,并用其对2017-2019年贵州部分地区的150份临床病料进行检测。多重PCR特异性检测结果表明:从混合病毒基因组中分别扩增出大小为224,353,424,549,684,831,1 137 bp的特异性片段,未扩增出E.coli、APP、PEDV及正常组织的DNA/RNA;敏感性试验表明,该方法对病毒的最低检测量分别为PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 20 pg、SIV 35 pg、JEV 17 pg、CSFV 14 pg;重复性试验表明:相同条件下的6次重复试验均能扩增出7个病毒的目的条带;应用试验表明:150份临床病料中二重感染阳性率高达66.00%(99/150);三重感染阳性率达11.33%(17/150);四重感染阳性率达2.00%(3/150);五重感染阳性率达0.67%(1/150);六重感染阳性率为0,七重感染阳性率为0,阳性PRRSV、PCV2、PPV、JEV、SIV的多重PCR与单一PCR的符合率均为100.00%,阳性CSFV和PRV的符合率为90.00%以上,研究建立的多重PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,对猪场猪呼吸和繁殖障碍类病毒病混合感染的快速诊断具有十分重要的意义。
2020年01期 v.40;No.277 32-37+48页 [查看摘要][在线阅读][下载 1188K] [下载次数：293 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：0 ] - 颜仁和;刘蕾;王升尧;李安迪;万鹏飞;仇珍珍;范根成;李红卫;杜元钊;高永新;
猪瘟E2基因工程亚单位疫苗能诱导机体产生抗CSFV中和抗体,被认为是最具应用前景的新型猪瘟疫苗。本研究利用稳定表达重组CSFV E2蛋白的细胞系HEK-293T-E2,制备E2亚单位疫苗并在动物体内检测其免疫原性。结果显示,制备的E2亚单位疫苗能成功诱导试验兔和仔猪产生抗CSFV抗体,相比对照组,试验动物能够抵抗猪瘟标准强毒石门株的攻击,并且没有产生体温升高及其他不良反应,证实了该疫苗的有效性和安全性。本研究为新型猪瘟亚单位疫苗的研发提供了重要线索。
2020年01期 v.40;No.277 38-41页 [查看摘要][在线阅读][下载 249K] [下载次数：690 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：1 ] - 孙雯;张莹辉;曹雨;朱真;杜吉革;李启红;陈小云;姚文生;钱莺娟;印春生;
为建立蓝舌病(bluetongue,BT)的血清学诊断方法,本研究通过得到14型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的s7基因,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,原核表达得到VP7蛋白,并对表达的包涵体VP7蛋白进行纯化,Western blot分析表明,纯化的VP7蛋白具有良好的抗原性。以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。该方法与羊痘阳性血清,羊口蹄疫阳性血清和羊的小反刍兽疫阳性血清均无交叉反应,与中和试验比较,两者符合率为90%,ELISA批内和批间重复性试验显示,D值的变异系数小于10%。说明本方法具有良好的特异性和重复性。本研究在国内首次建立了14型BTV抗体间接ELISA方法,可用于BTV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测,为以后相关BTV ELISA检测试剂盒研发提供技术平台。
2020年01期 v.40;No.277 42-48页 [查看摘要][在线阅读][下载 576K] [下载次数：192 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 张志;张丽丽;吴发兴;刘爽;董雅琴;张慧;张峰;崔进;李晓成;
塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)为小核糖RNA病毒科塞尼卡病毒属的单股正链RNA病毒,可引起猪的水泡样病变、跛行和新生仔猪突然死亡等,我国已经有多个省市检测到了本病毒。为建立一种快速高效、适应范围广的SVA检测方法,本研究以分离到的1株SVA流行病毒株GXT91作为参考毒株,设计合成了TaqMan探针和1对引物建立了SVA的荧光RT-PCR方法,并分别进行该方法的敏感性、特异性和重复性试验。结果显示:该方法的敏感性达到了17.4个分子拷贝/μL,与口蹄疫病毒、猪瘟病毒等病原无交叉反应,表明它具有较高的特异性,组间和组内重复性试验的变异系数均小于2%,表明其重复性较好。进一步运用该方法对48份临床样本进行检测,从中发现了12份阳性样品。这表明本研究建立的荧光RT-PCR是一种良好的诊断SVA的方法,可用于待测样本中SVA的诊断和流行病学调查监测等。
2020年01期 v.40;No.277 49-53页 [查看摘要][在线阅读][下载 839K] [下载次数：157 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：0 ] - 高倩文;孙举;尹燕博;徐守振;
为构建鸡源抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)单链抗体(scFv)文库并筛选出具有高亲和力的单链抗体。本研究从FAdV-4免疫鸡的外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法分别扩增出鸡抗体的VH和VL基因,通过Linker接头将VH和VL基因连接成scFv,将scFv基因连接至噬菌粒载体pComb3XSS中,构建单链抗体文库,通过噬菌体展示技术筛选抗FAdV-4单链抗体,并采用Phage ELISA方法检测抗体的亲和力。结果成功构建鸡源抗FAdV-4单链抗体文库,库容量为9.5×10~(10) PFU/mL,通过4轮"吸附-洗脱-富集"筛选,最终鉴定出1株与FAdV-4具有较高的亲和活性的单链抗体。该研究结果为进一步研究FAdV-4抗体奠定了基础。
2020年01期 v.40;No.277 54-58页 [查看摘要][在线阅读][下载 791K] [下载次数：235 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 郑博伟;刘亚静;张泽财;衣帆;王玮玉;蔡梦露;王浴光;王新平;
为筛选E种肠道病毒HY12毒株编码VP1蛋白的宿主互作蛋白,本试验应用PCR技术扩增出HY12病毒VP1蛋白基因的完整序列,并将其克隆到酵母载体pGBKT7中,构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP1。将重组质粒转化到酵母菌株AH109中,通过对比重组质粒组和空白质粒组不同时间点的D_(600)值,检测其对酵母细胞的毒性,并把含有诱饵重组质粒的酵母菌涂布在缺陷型培养基上验证其自激活活性。将转有诱饵载体的AH109菌株与表达MDBK细胞的cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基筛选杂交成功的菌落,并应用序列测定与比对分析和酵母回返试验等方法进行验证。提取阳性菌落的酵母质粒,通过缺陷型培养基及菌液PCR等方法,筛选到12个潜在HY12病毒VP1的互作蛋白,该结果为研究牛肠道病毒(BEV)感染机制及病毒结构蛋白VP1的功能等打下基础。
2020年01期 v.40;No.277 59-65页 [查看摘要][在线阅读][下载 1080K] [下载次数：502 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 陈为;王燕;金连海;常影;董明鑫;刘文森;许娜;
利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。首先,制备Cas9表达慢病毒,感染RAW264.7细胞,通过Puromycin抗性进行初步筛选,PCR法进行鉴定。其次,设计3条特异性识别TRIF基因的sgRNA(sgTi1、sgTi2、sgTi3),将其转入稳定表达Cas9蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察转入效果,PCR和Western blot法验证基因敲除情况。最后,挑选基因敲除效果最佳细胞株,经TRIF激活剂诱导后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测IFN-β表达水平。结果显示:感染后的RAW264.7-Cas9细胞Cas9基因扩增产物升高,说明成功获得稳定表达Cas9基因的RAW264.7细胞。含目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9细胞后,荧光显微镜下可明显观察到目的基因已成功导入;PCR结果显示,与对照组比较,分别导入sgTi1、sgTi2、sgTi3的3组RAW264.7细胞TRIF表达均受到抑制,Western blot进一步验证3组RAW264.7细胞TRIF蛋白表达均下降且sgTi1组下降最显著,说明TRIF基因敲除成功。经TRIF激活剂诱导,与RAW264.7-Cas9-NC细胞比较,敲除TRIF基因后RAW264.7细胞IFN-βmRNA水平受到明显抑制。结果表明:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。
2020年01期 v.40;No.277 66-71页 [查看摘要][在线阅读][下载 1330K] [下载次数：381 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张兰桥;赖崇德;戴益民;张庆华;钟其旺;赖芬菊;
为了鉴定胞内劳森菌(Lawsonia intercellularis,LI)外膜蛋白LI0902在细菌感染中的作用,本试验以胞内劳森菌疫苗DNA为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并成功构建诱饵表达载体pGBKT7-LI0902。将通过菌落PCR和测序验证的质粒转化酵母菌株Y2H Gold后,发现LI0902能在酵母细胞中正确表达,对酵母细胞无毒性,且无自激活活性。将含有pGBKT7-LI0902的酵母菌株Y2H Gold与猪肠上皮细胞系IPEC-1 cDNA文库菌株Y187进行杂交,筛选、验证、测序后得到3个与LI0902相互作用的宿主蛋白。本试验研究了胞内劳森菌与猪肠上皮细胞相互作用,为揭示增生性肠炎的致病机理提供了线索。
2020年01期 v.40;No.277 72-76页 [查看摘要][在线阅读][下载 433K] [下载次数：370 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 张佳琪;马新娜;张萍;王宁;邹云飞;纪元元;魏萍;
旨在探究食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)对轮状病毒(rotavirus,RV)的细胞受体热休克同源蛋白HSC70的调节作用。以饲喂食淀粉乳杆菌的中国昆明鼠乳鼠为试验动物,通过ELISA、qPCR、冰冻切片间接免疫荧光等技术,1～11 d逐日进行空肠组织取样,检测食淀粉乳杆菌对小鼠空肠组织中HSC70调节作用的动态变化。试验分为4组:正常组、病毒组、预防组(先益生菌作用后攻RV)、治疗组(先攻RV后作用益生菌)。试验结果显示,乳鼠体质量的增长率及变化情况与RV的感染相关,并且食淀粉乳杆菌可以显著地治疗及预防RV感染(P<0.05)。对空肠组织中HSC70的检测发现,攻RV后正常组及预防组的热休克同源蛋白HSC70含量在第5天显著高于治疗组和病毒组(P<0.05);在第7,11天时,各组组内热休克同源蛋白HSC70的含量无明显差异(P>0.05);第9天病毒组的热休克同源蛋白HSC70含量显著高于其他组(P<0.05)。HSC70 mRNA含量随天数的增加而减少,正常组下降趋势显著(P<0.05),预防组在第3,4天趋于平缓。攻RV后小鼠肠内HSC70 mRNA的相对表达量在第5,7,11天,呈现为病毒组>预防组>治疗组>正常组(P<0.05),且小鼠肠内HSC70 mRNA的相对表达量在第7天显著升高(P<0.05)。对第9天空肠组织进行冰冻切片-间接免疫荧光检测发现,HSC70主要存在于空肠绒毛组织,且预防组中HSC70明显少于病毒组及正常组(P<0.05)。结果表明,食淀粉乳杆菌可显著抑制RV受体HSC70在细胞中的合成,从而发挥抗病毒作用,为探究食淀粉乳杆菌抗RV机理提供理论依据。
2020年01期 v.40;No.277 77-82+96页 [查看摘要][在线阅读][下载 1528K] [下载次数：97 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 沙万里;闫满;刘东旭;尹柏双;李国江;
为探明乳酸菌在肠道中特异性诱导RegⅢγ表达会否通过MyD88介导途经,本研究通过给SPF级Balb/c小鼠口服灌胃高、低2种剂量的混合乳酸菌,检测分析小肠与结肠MyD88、RegⅢγ表达水平及相关性。结果显示:灌胃相同剂量混合乳酸菌小鼠小肠与结肠中RegⅢγ、MyD88 mRNA表达量、蛋白水平及蛋白荧光强度基本相同,均高于对照组小鼠表达水平;灌胃不同剂量混合乳酸菌并不能引起Th17细胞增强反应,HE染色各组肠道均没有出现炎症症状。结果表明:乳酸菌能够在肠道不同区域通过MyD88途径特异性诱导RegⅢγ的产生,同时对Th17细胞起到双向调控作用以维护肠道内环境稳定。
2020年01期 v.40;No.277 83-90页 [查看摘要][在线阅读][下载 2732K] [下载次数：110 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王亨;周钰奇;毕崇亮;祝启成;崔璐莹;孟霞;朱国强;李建基;
为探讨硒对金黄色葡萄球菌(S.aureus)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)自噬和细菌增殖的影响,本试验通过蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1和p62蛋白的表达,免疫荧光检测GFP-LC3与溶酶体的共定位,细菌平板计数检测胞内S.aureus增殖情况。结果发现S.aureus感染后,细胞内自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1和p62蛋白显著升高,GFP-LC3绿色聚点与溶酶体无明显共定位;硒添加后,能够显著或极显著降低S.aureus诱导的LC3和p62蛋白的表达,同时促进GFP-LC3与溶酶体的共定位,降低S.aureus的胞内增殖。综上所述,S.aureus感染诱导BMECs发生自噬,自噬体和溶酶体无法融合,自噬流阻塞。而硒促进自噬体和溶酶体融合,并缓解了自噬流的阻塞,降低S.aureus胞内增殖,这为临床金黄色葡萄球菌性乳腺炎的预防和治疗提供理论基础。
2020年01期 v.40;No.277 91-96页 [查看摘要][在线阅读][下载 2104K] [下载次数：285 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 郭建华;焦云娟;霍溢徽;段杨鑫婷;何深宏;刘威;任绍科;罗献梅;虞荣华;程方俊;
山羊海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)是造成山羊肺炎重要病原菌之一,其转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)结构与功能的研究对于阐明其致病机理有重要作用。本研究在前期分离鉴定菌株基础上,通过生物信息学分析结果显示,海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB包含氨基小叶(N-lobe)和羧基小叶(C-lobe)。分别对该菌TbpB~( 20-581 )(In-tact)、N-lobe、C-lobe进行克隆、表达与纯化,对纯化的蛋白与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白、猪转铁蛋白、牛转铁蛋白、鸡转铁蛋白进行特异性点阵杂交反应,发现山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB In-tact以及N-lobe与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白有特异结合反应,而与猪转铁蛋白、鸡转铁蛋白没有反应,山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB C-lobe与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白、猪转铁蛋白、牛转铁蛋白、鸡转铁蛋白均无反应。结果表明山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB与山羊转铁蛋白结合发生在N-lobe。
2020年01期 v.40;No.277 97-101页 [查看摘要][在线阅读][下载 557K] [下载次数：386 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 张安洁;杨勇;肖望成;徐孝青;曾邦权;肖啸;代飞燕;秦莉;
2017年9月云南省宜良某野生动物收容中心收容了5只马来穿山甲,都有严重的腹泻症状,粪便呈黑绿色、且带有脱落的黏膜,其中2只并发打喷嚏及呼吸困难等症状。试验无菌采集5只穿山甲的粪便棉试子及2份有呼吸道症状的鼻腔棉拭子,通过细菌分离鉴定、革兰染色、生化试验等对菌株进行初步测定,PCR扩增菌株的16S rDNA,测序后在NCBI上利用BLAST和MEGA软件进行序列相似性比较和系统发育学分析,结果表明:分离到的4株菌株分别为肺炎克雷伯菌、变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌及大肠杆菌O83∶H1;动物毒力试验根据小鼠在感染4株菌株96 h时的死亡情况,计算出肺炎克雷伯菌、变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌及大肠杆菌O83∶H1的LD50分别为4.37×10~8,1.15×10~8,1.29×10~8,4.15×10~(12) CFU/mL;药敏试验结果,肺炎克雷伯菌对大观霉素和头孢哌酮极度敏感,对新霉素等高度敏感,对卡那霉素等耐药;变形杆菌对头孢哌酮极度敏感,对链霉素等中度敏感,对头孢曲松等耐药;弗氏柠檬酸杆菌对大观霉素极度敏感,对头孢哌酮高度敏感,对头孢氨苄等低度敏感;大肠杆菌O83∶H1对环丙沙星和左氟沙星极度敏感,对头孢氨苄中度敏感,对卡那霉素低度敏感。
2020年01期 v.40;No.277 102-108页 [查看摘要][在线阅读][下载 919K] [下载次数：267 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 王艺凝;周建华;马丽娜;李学瑞;刘永生;
本试验拟研究生物被膜状态下外膜蛋白ompF基因与大肠杆菌Ⅰ类整合酶基因表达的相关性,初步探讨外膜蛋白对Ⅰ类整合酶基因的调控作用。利用Red同源重组系统构建大肠杆菌野生株的ompF基因缺失株和回复株,分别检测它们的生长曲线,并通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测生物被膜状态下亲本株,ompF基因缺失株和回复株的Ⅰ类整合酶基因mRNA的表达水平,分析它们的表达相关性。生长曲线检测发现ompF基因虽然不是大肠杆菌生长繁殖所必需的功能性基因,敲除后不会导致大肠杆菌的死亡,但会对大肠杆菌的生长有一定的影响。生物被膜状态下ompF基因缺失株Ⅰ类整合酶基因的表达水平比野生株明显降低,回复株Ⅰ类整合酶基因的表达水平有所升高,但未回复到野生株的表达水平。初步确定在生物被膜状态下,ompF基因对大肠杆菌Ⅰ类整合酶基因的表达有影响,此结果可为进一步研究生物被膜状态下大肠杆菌的耐药机制开拓新的研究方向。
2020年01期 v.40;No.277 109-115+161页 [查看摘要][在线阅读][下载 1861K] [下载次数：279 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 胡慧慧;孙亚伟;李文娅;邝启红;孙华润;吴华;胡功政;苑丽;
为构建调节蛋白H-NS及双组分信号转导系统CpxAR的单、双基因缺失株,本研究以大肠杆菌ATCC25922为研究对象,以pKD4质粒为模板,分别扩增出含kan~r基因的线性打靶片段,在pKD46质粒的辅助及L-阿拉伯糖的诱导下进行Red同源重组,使线性打靶片段替换大肠杆菌ATCC25922中的cpxR、hns基因,再用pCP20质粒消除FRT位点间的kan~r基因,构建单基因缺失株△cpxR和△hns。接着以△cpxR为研究对象,用同样方法敲除hns基因,构建双基因缺失株△cpxR△hns。最后将重组表达质粒cpxR-pBAD/HisA、hns-pBAD/HisA电转入上述3种缺失株中,制备回补菌株△cpxR/pcpxR、△hns/phns、△cpxR△hns/pcpxR和△cpxR△hns/phns。结果表明,利用该重组系统成功敲除了大肠杆菌ATCC25922中cpxR、hns基因,构建了单、双基因缺失株△cpxR、△hns和△cpxR△hns以及它们的回补菌株,为研究H-NS及CpxAR互作调控IncFⅡ质粒接合作用的分子机制提供了有力的工具。
2020年01期 v.40;No.277 116-121页 [查看摘要][在线阅读][下载 609K] [下载次数：427 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：3 ] - 金鑫;张曼;王云鹤;魏方;温婧怡;杨银凤;
为了探索膜受体Dectin-2和TLR-2在酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达过程中的作用。本研究首先利用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法确定Dectin-2是否在ORECs内表达;然后采用qPCR和Western blot方法检测甘露聚糖刺激ORECs后Dectin-2和TLR-2的表达变化;最后用qPCR和ELISA方法检测不同质量浓度(0.1,1.0,10.0 mg/L)的Dectin-2和TLR-2特异性封闭抗体对甘露聚糖诱导SBD-1表达的影响。结果显示:ORECs内表达Dectin-2,且甘露聚糖刺激ORECs后Dectin-2和TLR-2的表达量均显著增加(P<0.01);同时甘露聚糖可以诱导SBD-1的表达(P<0.01),但是该表达过程可以被不同质量浓度的Dectin-2封闭抗体和TLR-2封闭抗体所抑制(P<0.05),且随着抗体浓度的增加,这种抑制作用越明显。此外,在封闭抗体质量浓度相同时,Dectin-2封闭抗体比TLR-2封闭抗体抑制SBD-1表达的作用更明显(P<0.05)。结果表明,酿酒酵母甘露聚糖诱导SBD-1的表达与Dectin-2和TLR-2受体有关,但是Dectin-2在此过程中发挥更主要的作用。
2020年01期 v.40;No.277 122-128页 [查看摘要][在线阅读][下载 1485K] [下载次数：89 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 张石磊;包佳鹭;史万玉;钟秀会;
双酚A(BPA)是一种无处不在的环境雌激素,长期暴露或接触会影响动物的生殖功能。为了探究持续低剂量暴露BPA对雄鼠生殖器官和功能的影响,将妊娠0 d孕鼠随机分为7组,每组20只,分别为空白对照组,0.05 mg·kg~(-1)·d~(-1) BPA组,0.50 mg·kg~(-1)·d~(-1) BPA组,5.00 mg·kg~(-1)·d~(-1) BPA组,10.00 mg·kg~(-1)·d~(-1) BPA组,20.00 mg·kg~(-1)·d~(-1) BPA组, 50.00 mg·kg~(-1)·d~(-1) BPA组。自母鼠怀孕0 d起持续饮水染毒BPA至哺乳期结束,仔鼠21 d断奶后直接以继续饮水染毒至45日龄性成熟期,共染毒63 d。子代雄鼠于45 d处死。结果显示,染毒BPA剂量大于等于10.00 mg·kg~(-1)·d~(-1)时雄鼠血清BPA含量显著高于空白对照组(P<0.05),染毒BPA剂量大于等于20.00 mg·kg~(-1)·d~(-1)时睾丸组织BPA含量显著高于空白对照组(P<0.05)。H&E染色和睾丸器官指数测定结果显示染毒BPA剂量10.00 mg·kg~(-1)·d~(-1)以上导致睾丸生精小管萎缩,小管间隙变大,50.00 mg·kg~(-1)·d~(-1)以上导致子代雄鼠睾丸指数显著增大(P<0.05)。染毒BPA剂量在0.50 mg·kg~(-1)·d~(-1)以上时睾丸精子活力与密度相较于空白对照组均显著减少(P<0.05),而各染毒组精子畸形率均显著大于空白对照组(P<0.05)。染毒BPA剂量在0.50 mg·kg~(-1)·d~(-1)以上时睾丸生殖细胞核DNA损伤显著大于空白对照组(P<0.05)。染毒BPA剂量在0.05 mg·kg~(-1)·d~(-1)以上时睾丸雄激素受体(AR)表达量显著减少(P<0.05)。转录组测序结果显示染毒BPA可导致雄鼠睾丸剪切体U1亚基蛋白质C合成基因Snrpc和剪切体通用载体组件编码基因Hnrnpu均显著下调,使得mRNA的转录后修饰第一步即无法进行,剪切体功能受阻可能是BPA影响睾丸发育的重要原因。荧光定量PCR证实了转录组结果,并进一步证明了Hnrnpu对BPA的敏感性大于Snrpc。
2020年01期 v.40;No.277 179-187+209页 [查看摘要][在线阅读][下载 4452K] [下载次数：171 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 代子诺;何其杰;乔蕾;何莉娜;黄思艺;赵中权;
为了筛选出与精子发生有关的lncRNAs,本研究利用Illumina HiseQ 4000平台对山羊在出生期、初情期和成年期3个阶段的睾丸进行了lncRNAs测序分析。共产生了8 183个新的lncRNAs转录本。不同组间lncRNAs的差异表达分析显示,分别有1 167,5 392和5 465条lncRNAs转录本的表达有显著性差异,随机选择9个差异表达的基因进行qPCR验证,定量结果与测序结果一致。对lncRNAs的靶基因进行预测,其中5 477个编码蛋白的基因受到顺式作用调控,445个编码蛋白的基因受到反式作用调控。将差异显著的lncRNAs的靶基因进行了GO功能富集分析和KEGG途径富集分析,共有57个候选mRNA富集到精子发生功能中,它们分别靶向到50条新发现的lncRNAs,选出3个进行qPCR验证发现其在不同时期差异显著且表达趋势与靶基因一致,推测这些lncRNAs可能对靶基因有调控作用。该研究为进一步了解lncRNAs在睾丸发育和精子发生中的功能和机制提供了数据支持,极大地缩小了与精子发生相关lncRNA的研究范围,为揭示雄性的生殖功能提供了重要靶点。
2020年01期 v.40;No.277 188-195页 [查看摘要][在线阅读][下载 4009K] [下载次数：175 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李常红;赵寒冬;程云云;郝林琳;滕肇慧;
在动物生长调控过程中,IGF1是发挥关键作用的垂体-IGF1-靶器官生长轴上最重要的因子之一。IGF1的表达与动物出生前后的生长均密切相关。miRNAs是1类非编码单链RNA,通过碱基互补配对的方式与靶基因的3′UTR区部分或完全互补,降解靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译,从而起到转录后调控靶基因表达的作用。本研究以在大鼠垂体中高表达的miR-709为研究对象,通过生物信息学分析、双荧光素酶报告系统鉴定确定IGF1为其直接靶基因,然后进一步采用qRT-PCR及Western blot技术检测miR-709对IGF1表达量的影响。结果显示,miR-709显著抑制IGF1在RNA及蛋白质水平的表达量,表明miR-709可通过直接靶向IGF1基因抑制其表达。本研究将为miR-709调控动物生长研究领域提供数据。
2020年01期 v.40;No.277 196-202页 [查看摘要][在线阅读][下载 970K] [下载次数：77 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 张宇辰;李文杰;袁建彬;臧树成;王立鹏;朗立敏;陈妍;杨焕民;
本研究旨在分析籽鹅头顶部羽束性状(crest trait)相关调控基因,从而进一步揭示禽类表型性状与调控基因的作用机制,为后续分子遗传育种、禽类基因编辑等提供理论基础。本试验选取同家系同世代1日龄籽鹅作为试验样本,构建2个资源群体,每群体60只雏鹅,饲养周期为21 d。有羽束鹅群(crest population,C):该群体均为有羽束公雏;无羽束鹅群(non-crest,NC):该群体均为无羽束公雏,2个群体同舍分栏饲养。随后,为测定肝脏组织中eomes、hoxc8、sox5、mnr2、wnt5a、bmp2、gh候选基因相对表达量,在1,7,14,21日龄进行采样,应用qRT-PCR技术进行检测。结合生物信息学分析方法,分析调控羽束性状的关联基因。在qRT-PCR分析结果中,sox5基因在1日龄雏鹅肝脏组织中相对表达量,C组高于NC组,并且差异极显著(P<0.01)。其他时期虽无显著差异,但羽束鹅群仍高于无羽束鹅群相对表达量高。wnt5a基因在1日龄雏鹅肝脏中相对表达量,C组高于NC组,差异极显著(P<0.01),在其他时期无显著差异。通过生物信息学分析,结合Multiexperiment Viewer软件对候选基因进行聚类分析,sox5、wnt5a、bmp2基因可能均在同一调控通路中。结果提示,sox5基因可能为羽束性状调控基因,与wnt5a基因在同一信号通路中,并对羽束性状发育起到调控作用,sox5、bmp2基因可能在肝脏发育、代谢过程中起到调控作用。
2020年01期 v.40;No.277 203-209页 [查看摘要][在线阅读][下载 1057K] [下载次数：68 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]