- 焦秋林;姜子昕;孟凡亮;曹龙龙;李焱;杨玉栋;佟泽;刘思当;
2019年1月山东省莱芜某猪场保育猪在免疫猪瘟(classicai swine fever,CSF)疫苗后发病,病死率高达60%。对病猪进行实验室综合诊断,确诊为猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)感染,经检测分离毒株(Laiwu2019)存在变异。为进一步了解山东地区CSFV遗传进化情况,2019年上半年从山东部分地区收集23份CSF疑似病料,确定17份阳性并成功分离到14株CSFV,对分离毒株的E2基因进行遗传进化分析。结果表明,分离的15株CSFV间的核苷酸与推导氨基酸的同源性分别为97.0%～99.9%和97.1%～100.0%,与参考株间的同源性分别为81.9%～97.4%和88.7%～99.7%。通过与Shimen株糖基化位点分析,分离株仅在"~(986)NYAK-NYTK~(989)"处发生突变。分离毒株与Shimen株抗原表位分析比较,15株分离株在抗原表位"~(717)TTWKEYSH~(724)"发生了"K~(720)R"的突变,在"~(771)LLFDGTNP~(778)"处发生了"N~(777)S"的突变,LaiWu2019同时发生了"G~(775)T"的突变;在抗原表位"~(829)TAVSPTTLR~(837)"处,SDCP-19株发生了"S~(832)C"的突变。通过遗传进化树分析,分离株位于相对独立一支,与近几年2.1d亚型变异株遗传关系最近,属于变异毒株。
2020年09期 v.40;No.285 1665-1670页 [查看摘要][在线阅读][下载 5002K] [下载次数：340 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：1 ] - 崔建涛;韩昊莹;党家刚;赵宇;田润博;陈红英;郑兰兰;杨明凡;
为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本研究对2016—2018年间从河南和山西等地多个规模化猪场随机采集的25份患有腹泻仔猪小肠及内容物提取RNA进行PEDV RT-PCR检测,阳性样品进行S全基因克隆、遗传进化与重组分析。结果显示,25份腹泻仔猪样品中检测出18个PEDV阳性样品,成功克隆18株PEDV毒株S全基因序列,与GenBank中发表的30条PEDV S基因序列进行比较分析,核苷酸同源性均在92.8%以上,存在多处碱基点突变、插入与缺失,且SX-TY1-2017毒株在3 291～4 132 nt位置处发生重组,可能是由亲本株CH/HNZZ47/2016和HN-KF-2017重组产生的。基于S全基因遗传进化树结果,克隆的18株PEDV属于G2群且位于不同分支,表明PEDV流行株在2016—2018年间出现一定的变异。
2020年09期 v.40;No.285 1671-1676页 [查看摘要][在线阅读][下载 1287K] [下载次数：419 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：1 ] - 李悦;张会霞;张慧;姜胜男;宋一诺;刘思当;
为了解山东省规模化蛋鸡养殖场H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的流行情况,本研究于2018年1月至12月在山东省部分地区(聊城、泰安、济南、淄博、东营、菏泽、济宁、德州、临沂、潍坊)规模化蛋鸡场收集105份发病鸡组织样品和2 424份血液样品,剖检并采集病料,RT-PCR方法检测H9N2亚型AIV,分离病毒并进行HA基因测序分析;常规石蜡切片HE染色镜检患病鸡的组织病理学变化;血凝抑制试验检测血清抗体。结果显示,105份组织样品中18份AIV检测阳性,经鉴定全部为H9N2亚型,其中3月份的检出率最高,占43.75%,6-10月份以及12月份未检出;产蛋鸡群H9N2亚型AI抗体平均水平较高,其中2月份抗体滴度最高,达到11.26log2,且抗体水平过高(HI≥12log2)的比例较大,可能与春冬季鸡群感染比例较高或养殖场强化免疫有关。6月份抗体滴度最低,平均为7.13log2,且两极分化明显,离散度较大,可能与新老鸡群并存有关。10株分离株的HA基因属于Y280-like分支,与G57基因型处同一分支。综上可知,2018年山东省蛋鸡场H9N2亚型AI免疫强度较大,鸡群整体免疫状态较好,但在夏秋季节抗体水平偏低且离散度较大,冬春季仍有疫情散发,HA基因抗原漂移可能会导致鸡群免疫失败,蛋鸡群AI的防控工作不能放松,尤其要加强免疫程序调整优化及抗体监测评估工作。
2020年09期 v.40;No.285 1677-1682页 [查看摘要][在线阅读][下载 3533K] [下载次数：200 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：3 ] - 郑慧华;田润博;徐通;崔建涛;侯承尧;赵宇;郑兰兰;刘芳;陈红英;
将猪伪狂犬病病毒(PRV)转移质粒pUC-TKLR与含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的gE/gI/TK三基因缺失PRV变异株rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-/EGFP~+基因组经脂质体转染至ST细胞中,进行无荧光重组病毒蚀斑筛选、纯化,并对该病毒在多种细胞上增殖特性、病毒滴度、一步生长曲线和遗传稳定性及其对小鼠的安全性等进行初步研究。结果显示,成功获得重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-,不含EGFP。经PCR及测序鉴定,证实获得的rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-在TK基因上缺失311 bp。rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-在ST、PK-15、VERO和MDCK细胞上的TCID_(50)分别为10~(6.375)/0.1 mL,10~(5.625)/0.1 mL,10~(5.375)/0.1 mL,10~(3.875)/0.1 mL;与亲本毒株NY在ST细胞中的毒力(10~(6.5)/0.1 mL)相近;当rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-传至20代时,病变细胞仍无绿色荧光,缺失部分TK基因(311 bp),且对小鼠是安全的。
2020年09期 v.40;No.285 1683-1689页 [查看摘要][在线阅读][下载 4622K] [下载次数：165 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 何金科;杨亚军;邓肖玉;何延华;张超;马忠臣;王震;陈创夫;
为了筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白的多表位亚单位疫苗,本研究选用4种B细胞预测软件(immunomedicine group、ABCpred、BepiPred、SMVTriP)和2种T细胞预测软件(NetBoLApan、NetMHCIIpan)筛选出重叠肽作为优势表位,通过柔性linker连接成多表位疫苗,使用免疫信息学方法对抗原性、过敏源、理化性质、糖基化位点、二级和三级结构进行评估。通过二硫化物工程提高疫苗稳定性。使用分子对接评估疫苗构建体与免疫受体的结合能力,最后进行silico克隆。结果表明,成功构建17 000相对分子质量的可溶性蛋白质,免疫信息学结果表明,疫苗构建体是非过敏性良好抗原,具有一个潜在的N-糖基化位点,在二级结构中α螺旋占约3.2%,β折叠占约43.2%,无规卷曲占约53.6%。三级结构Ramachandran作图发现优势区域中含有88.2%残基,进行细化后优势区域的残基增加到93.5%,3D模型表位作图也证明多表位疫苗具有良好的免疫原性,二硫化物工程确定出3对残留物可以形成二硫键,分子对接表明疫苗构建体与TLR3受体具有高亲和力,最后密码子优化和silico克隆确保设计的亚单位疫苗在大肠杆菌K12表达系统中更高表达。免疫信息学分析表明这种多表位疫苗可以有效表达并能够诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为BVDV E2多表位疫苗的设计提供了一种新的方法。
2020年09期 v.40;No.285 1690-1698页 [查看摘要][在线阅读][下载 3979K] [下载次数：580 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：2 ] - 柏玲;朱言柱;潘悦;吕甜甜;张蕾;
为实现水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus,ADV)部分VP2基因的可溶性表达,进一步探究目的蛋白的反应原性,本研究利用基因工程技术克隆ADV衣壳蛋白VP2部分基因,并亚克隆至原核表达载体pET30a(+)中,获得重组表达载体pET-30a-M,经诱导表达后,SDS-PAGE确定蛋白表达形式,尝试降低诱导温度及诱导剂浓度来增加可溶性蛋白表达量,但效果不显著;随后,为增加可溶性表达,尝试将pET-30a-M分别与pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16 5种伴侣蛋白共表达。通过SDS-PAGE筛选有效的伴侣蛋白,将伴侣蛋白pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16 5种质粒分别转入感受态细胞BL21(DE3),将pET-30a-M质粒分别转入含各种伴侣蛋白的感受态细胞。各种共表达菌株经双抗性筛选,诱导剂诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达情况。并从诱导温度和伴侣蛋白诱导剂L-Arabinose剂量两个方面筛选最佳表达条件。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明重组表达载体pET-30a-M诱导表达后,蛋白主要以包涵体形式存在,与伴侣蛋白pKJE7共表达后,上清中的可溶性目的蛋白的含量增加,相对分子质量约为70 000,且具有反应原性;与pG-KJE8、pGro7、pG-Tf2和pTf16伴侣蛋白共表达,未见可溶性蛋白增加。随着温度的降低,30℃与25℃比37℃上清中的可溶性蛋白表达量有所增加,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大。pKJE7伴侣分子可以促进pET-30a-M可溶性表达,且表达量不受L-Arabinose诱导剂量影响,随着温度降低,可溶性蛋白表达量有所增加,表达的蛋白具有反应原性,本研究为进一步探究该蛋白的生物学功能奠定基础。
2020年09期 v.40;No.285 1699-1706页 [查看摘要][在线阅读][下载 1119K] [下载次数：341 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：1 ] - 林裕胜;江锦秀;张靖鹏;游伟;胡奇林;
为获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)古田株(暂命名为:ENTV/CH/GT/2015株)全基因组序列。通过PCR方法从山羊鼻内肿瘤组织中分段扩增获得ENTV-2全基因组7个片段,目的片段经胶回收后分别连接至pMD19-T载体上,并转化至基因工程菌DH5a,提取阳性质粒进行测序,利用生物学软件对获得的序列进行拼接分析。获得ENTV/CH/GT/2015株全基因组序列长度为7 506 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及5′端非编码区,并上传至GenBank上获得登录号为MK210250.1;与国外NC004994.2株和AY197548.2株核苷酸同源性均为87.5%,与国内ENTV-2CHN8株核苷酸同源性为97.7%。氨基酸序列分析结果显示,gag蛋白在124～126 aa插入GVE 3个氨基酸和229～232 aa插入APPP 4个氨基酸,env蛋白在590～593 aa处存在AESL 4个氨基酸的缺失;gag和env蛋白抗原表位分析结果显示,尽管存在氨基酸的突变和缺失,但抗原表位并没有明显差异。糖基化位点预测结果显示:gag、pro、pol和env蛋白分别含有1,1,4,6个糖基化位点,均可能不包含信号肽。遗传进化树分析结果推测,该毒株是国内ENTV-2CHN2株和ENTV-2CHN10株变异毒株。本研究获得ENTV/CH/GT/2015株全基因序列并明确其生物学特性,不仅丰富了ENTV-2全基因序列库,还为今后研究ENTV-2快速检测方法及致病机理提供了研究素材。
2020年09期 v.40;No.285 1707-1714页 [查看摘要][在线阅读][下载 10731K] [下载次数：206 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 张林吉;迟兰;李心海;王玉燕;任士飞;张小荣;吴艳涛;
为提高鸡心包积液-肝炎综合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)和鸡包涵体肝炎(inclusion body hepatistis,IBH)疾病的防控能力,研制有效防控Ⅰ群禽腺病毒(FAdV)疫苗。本研究将实验室分离鉴定的FAdV-4 SN2016株和FAdV-8标准毒株,采用鸡胚增殖方式,优化最佳接种剂量、收获时间及甲醛的灭活条件,病毒抗原以3∶1比例混合,制备双价油乳剂灭活疫苗,检验疫苗性状、监测免疫后雏鸡的抗体水平及对其免疫保护效果。病毒采用卵黄囊接种,尿囊液中病毒粒子含量分别达到4.6×10~8和7.8×10~7拷贝/mL;灭活条件为终浓度1.5‰的甲醛灭活24 h;制备的疫苗为油包水剂型,物理性状稳定,无菌检测合格,4℃保存期可达12个月;雏鸡免疫抗体水平监测结果显示,免疫后3～4周抗体水平达到高峰,第6周依然维持较高水平,制备的双价油乳剂灭活疫苗可以有效抵抗单病毒和双病毒的攻击。研究结果显示制备的FAdV-4 SN2016和FAdV-8双价油乳剂灭活疫苗性状稳定、保存期长,免疫效果好,能有效抵抗病毒攻击,为HHS和IBH疫病的防控提供有效手段。
2020年09期 v.40;No.285 1715-1719页 [查看摘要][在线阅读][下载 640K] [下载次数：454 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：16 ] |[阅读次数：1 ] - 王孟月;吴芃;程艺;田辉;张素玲;王彦伟;李向东;逄文强;田克恭;
对禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC基因进行大肠杆菌密码子优化,并将优化后的σC基因及其截短片段(122/156/192～326位氨基酸)克隆至pET-28a(+)载体,分别构建pET-28a(+)-σC,pET-28a(+)-σC-122,pET-28a(+)-σC-156和pET-28a(+)-σC-192重组载体。将测序鉴定正确的阳性质粒分别转化E.Coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导后产物经Western blot分析检测,显示σC及其截短蛋白σC-122、σC-156和σC-192在大肠杆菌中获得正确表达,相对分子质量分别为37 000,25 000,22 000和18 000,均能与ARV阳性血清发生特异性反应。本研究通过温度调控双水相萃取以及无机盐多步蛋白盐析沉淀前处理工艺,去除大肠杆菌表达重组蛋白中99%的内毒素。纯化后的σC及其截短蛋白,免疫21日龄SPF鸡,并于免后28 d进行抗体检测,结果显示截短蛋白免疫组血清抗体阳性比例仅为4/10,但重组蛋白σC免后抗体阳性比例可达到8/10,与全病毒类似,可作为ARV亚单位疫苗开发的候选蛋白。
2020年09期 v.40;No.285 1720-1725页 [查看摘要][在线阅读][下载 724K] [下载次数：279 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：1 ] - 任梦婷;姜磊;刘亮亮;李慧昕;张莉莉;侯雨彤;马得莹;
以鹅为研究对象,人工感染禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV),分别在攻毒后36,72 h和3,7 d,采集脾脏、哈德氏腺、骨髓、法氏囊和盲肠扁桃体,运用实时荧光定量PCR,检测鹅感染FAdV-4后,免疫器官中FAdV-4载量及免疫相关因子基因表达差异,初探FAdV-4对鹅致病性以及鹅对该病毒的天然免疫反应机制。结果表明,与对照组相比,在法氏囊、盲肠扁桃体和哈德氏腺中检测到FAdV-4,感染初期TLR2和TLR3显著上调,感染后期TLR5和TLR15显著下调;AvBD1、AvBD9、AvBD10和AvBD16在部分组织中表达量显著升高,且大部分细胞因子表达受到抑制。研究表明,感染FAdV-4后,会激活宿主先天免疫反应,为研究FAdV-4与宿主先天免疫的相互作用提供新的思路。
2020年09期 v.40;No.285 1726-1736页 [查看摘要][在线阅读][下载 5362K] [下载次数：200 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 张石磊;翟向和;王春光;贾泽;张铁;
本试验鉴定禽源耐药大肠杆菌1株,命名为Coli0,其小檗碱亚抑菌质量浓度(1/2 MIC)为250 mg/L。药敏试验显示Coli0对左氧氟沙星、头孢菌素、庆大霉素和氨苄等9种抗生素耐药。经小檗碱处理后多耐药大肠杆菌对左氧氟沙星耐药性部分消除,得到耐药消除菌5株,分别命名为Coli1、Coli2、Coli3、Coli4和Coli5。对Coli0菌株进行全基因组测序,显示其基因组由1个序列长度为4 858 944 bp的核DNA和2个质粒DNA组成,注释得到的基因总数4 883个,耐药基因67个。对Coli0和Coli1进行耐药基因荧光定量PCR,结果显示小檗碱处理后共有18个耐药基因发生显著变化,其中acrR、mexE、sul2、mdtH、mdtL、cpxR、phoQ和pmrC显著下调,mdtE、gyrA、gyrB、macA和macB显著上调,bacA、acrE和emrK消失,mdtA和baeR新产生。小檗碱通过阻碍大肠杆菌多药耐药外排泵表达,影响细胞壁合成,导致耐药质粒丢失和上调抗生素靶蛋白表达等多方面影响细菌抗药性。而macAB耐药外排泵活性增强可能是细菌抵抗小檗碱的反应,这预示着尽管Coli0和Coli1小檗碱的MIC并未改变,大肠杆菌可能会对小檗碱也有耐药现象。
2020年09期 v.40;No.285 1737-1745页 [查看摘要][在线阅读][下载 3885K] [下载次数：465 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：1 ] - 白帆;吴金迪;王晓晖;吕天星;王艳芳;郝永清;
为证明TLR2是否参与绵羊肺炎支原体(Mo)或LAMPs刺激肺泡巨噬细胞时细胞因子的表达,使用Mo或LAMPs刺激绵羊肺泡巨噬细胞后,利用荧光定量PCR、流式细胞术、Western blot以及ELISA等方法分别对TLR2转录和翻译水平、MAPK信号通路激活情况和IL-1β分泌情况进行检测。同时,使用TLR2抑制抗体及MAPK抑制剂后,利用荧光定量PCR、Western blot以及ELISA检测MAPK信号通路激活情况和IL-1β分泌情况。结果显示,绵羊肺泡巨噬细胞受Mo或LAMPs刺激后,TLR2在基因和蛋白表达水平均有不同程度上升,MAPK信号通路中各信号蛋白均发生磷酸化反应,IL-1β在基因和蛋白表达水平均有不同程度上升。对TLR2及MAPK功能抑制后,MAPK信号通路的激活及IL-1β的表达均受到明显抑制。结果提示,Mo及其LAMPs可通过绵羊肺泡巨噬细胞的TLR2受体激活MAPK信号通路,继而引起细胞因子IL-1β的分泌增多。
2020年09期 v.40;No.285 1746-1753页 [查看摘要][在线阅读][下载 3071K] [下载次数：264 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 蔺焕然;史泽风;郭庆勇;孙昭宇;赵艳兵;杨德吉;姚大伟;
提取南京地区经鉴定确诊为犬吉氏巴贝斯虫感染病犬血液中的DNA,设计引物采用PCR方法扩增犬吉氏巴贝斯虫HSP70基因,克隆至pET-32a质粒中,转化Rosetta-gami(DE3)pLyS大肠杆菌,利用IPTG诱导表达得到重组热休克蛋白(heat shock protein 70,HSP70)。用Ni柱纯化重组HSP70蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并分析重组蛋白的免疫原性及反应原性。本研究成功构建了pET-32a-hsp70重组质粒,IPTG诱导后表达出可溶的重组HSP70蛋白。经过Western blot分析,表达的重组蛋白不但能够免疫小鼠产生抗体,还可以和天然犬吉氏巴贝斯虫抗血清发生特异性反应,为进一步建立犬巴贝斯虫免疫血清学诊断和疫苗抗原的开发奠定基础。
2020年09期 v.40;No.285 1754-1757+1764页 [查看摘要][在线阅读][下载 948K] [下载次数：192 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 唐天才;刘城成;魏巍;袁东波;郭莉;侯巍;莫茜;阳爱国;杨晓农;郝力力;
为了解四川省石渠县牦牛体表寄生蜱携带无形体与疏螺旋体的种类和感染情况。采集牦牛体表寄生蜱,经形态学和分子生物学鉴定,确定蜱种类。再采用巢式PCR分别扩增无形体科16S rRNA基因和疏螺旋体属的16S rRNA与flaB基因片段,并对阳性产物进行测序、比对和系统进化树构建,从而确定无形体和疏螺旋体的种类。结果显示,共采集到818只蜱,其中西藏革蜱占78.97%(646/818)、青海血蜱占21.03%(172/818)。所有蜱中有132只检出无形体,阳性率为16.14%;8只检出疏螺旋体,阳性率为0.98%;3只蜱混合感染牛无形体和疏螺旋体。经进一步分析,仅在青海血蜱中检测到牛无形体(Anaplasma bovis)、埃立克体(Ehrlichia)和疏螺旋体(Borrelia),其阳性率分别为6.98%(12/172),2.33%(4/172)和4.65%(8/172);仅在西藏革蜱中检测到绵羊无形体(Anaplasma ovis),其阳性率为17.96%(116/646)。此外,获得的疏螺旋体16S rRNA和flaB基因序列均与分离自日本大刺血蜱中的Borrelia sp.HM菌株亲缘关系最近。结果提示,四川石渠县存在牛无形体、绵羊无形体、埃立克体未定种以及疏螺旋体未定种,存在感染人的风险。
2020年09期 v.40;No.285 1758-1764页 [查看摘要][在线阅读][下载 1086K] [下载次数：236 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：1 ]
- 王梦佳;孟宪华;宣国彦;刘莹;韩磊;彭志豪;范京惠;左玉柱;李清艳;
为探究Ⅰ型整合子-耐药基因盒对克雷伯菌耐药性产生和传播的影响及该菌的致病性,针对本实验室分离到的猪源克雷伯菌进行Ⅰ型整合子扩增及可变区序列分析,分析其结构及与耐药性关系,建立分离菌株感染动物模型,从临床症状、病理变化、细菌学检查和组织病理学4个方面开展研究。结果显示,该菌株主要以介导甲氧苄啶类耐药drfA为主,与其药敏试验耐药表型一致,感染动物模型发生实质器官病变且在病理切片中可见组织中大量炎性细胞浸润,肝、脾血窦开放和充血等病变。
2020年09期 v.40;No.285 1765-1769+1776页 [查看摘要][在线阅读][下载 1523K] [下载次数：107 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 徐翩翩;唐亦然;孟祥苗;毕斯琪;胡燕萍;杨杨;宋厚辉;
为探索牛分枝杆菌通过RIPK1来调节细胞凋亡的作用机制,本试验利用分子克隆技术构建诱饵质粒pGBKT7-RIPK1,并通过PEG/LiAc转化法将该质粒转入酵母菌中,经Western blot验证RIPK1在酵母菌中的表达情况后,使用该重组酵母菌筛选牛分枝杆菌基因组文库;筛选所得阳性克隆经互补验证、测序分析以及免疫共沉淀法,最终确定可与RIPK1互相作用的牛分枝杆菌蛋白。结果表明,成功构建诱饵质粒pGBKT7-RIPK1,该诱饵质粒可在酵母菌中表达RIPK1蛋白;用该酵母菌筛选牛分枝杆菌基因组文库共获得16个阳性克隆;这些阳性克隆经互补验证、测序和BLAST对比后共发现翻译正确的7个牛分枝杆菌蛋白;分别构建RIPK1和牛分枝杆菌候选蛋白的真核表达载体,经免疫共沉淀验证后发现可与RIPK1互作的3个牛分枝杆菌蛋白,分别为Mb0869c、Mb0383c和Mb2314,本研究为进一步研究牛分枝杆菌通过RIPK1调节细胞凋亡的作用机制提供数据支持。
2020年09期 v.40;No.285 1770-1776页 [查看摘要][在线阅读][下载 1176K] [下载次数：362 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 潘永;杨阳;李晨;刘丽娟;杨琦;
trpE基因在鼠伤寒沙门菌中编码邻氨基苯甲酸合酶Ⅰ并参与氨基酸生物合成和代谢。为鉴定鼠伤寒沙门菌Hfq依赖型小RNA GcvB所调控的基因trpE,本研究基于前期鼠伤寒沙门菌Hfq基因敲除株及gcvB基因敲除株转录组分析基础上,利用Red同源重组系统构建trpE基因lac融合菌株,并利用P22噬菌体转导技术构建gcvB和Hfq基因单缺失和双缺失菌株,通过β半乳糖苷酶试验检测trpE基因在不同情况下蛋白表达活性,结合生物信息学系统TargetRNA2预测GcvB R1区与trpE mRNA的作用位点。结果表明,与野生型菌株相比,gcvB基因敲除导致trpE基因蛋白表达量增加1.2倍,Hfq基因敲除后表达量增加1.1倍,而双敲除增加量仅为0.5倍。Target RNA2预测trpE mRNA与GcvB R1区可形成8个连续或18个不连续的碱基互补。以上结果表明trpE基因受GcvB和Hfq调控,且极大可能受GcvB直接调控。本研究为鼠伤寒沙门菌GcvB的作用机理研究奠定理论基础,丰富了GcvB的靶基因数目。
2020年09期 v.40;No.285 1777-1782页 [查看摘要][在线阅读][下载 770K] [下载次数：247 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：1 ] - 郑双健;李东方;陈远才;曹乐天;王璐阳;黄建营;刘东海;李豪;张龙现;
为了解河南省郑州地区奶牛隐孢子虫及安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni,C.andersoni)的亚型分布情况,本研究共采集3个奶牛场共973份奶牛新鲜粪便样品,采用显微镜检测方法进行隐孢子虫检测,对形态学鉴定的8份C.andersoni阳性样品分别基于SSU rRNA、Actin、HSP70和COWP基因位点进行虫种鉴定,基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16基因位点进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析。结果显示,隐孢子虫总感染率为2.77%(27/973),而且以断奶前犊牛感染率最高7.10%(12/169)。8份样品在不同基因位点均成功鉴定为C.andersoni分离株,并形成4个MLST亚型,其中A4、A4、A4、A1为优势亚型,A6、A4、A2、A1为新亚型,且不同亚型的卵囊大小具有显著差异。研究表明,河南省郑州地区奶牛隐孢子虫总体感染水平较低,但是对奶牛养殖业和牛奶产量仍然有较大影响,此外,C.andersoni存在多个MLST亚型,表明具有遗传多样性。
2020年09期 v.40;No.285 1783-1790页 [查看摘要][在线阅读][下载 1136K] [下载次数：260 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：1 ] - 赵少伟;王楠;谢素珠;王浩;张爽;张煊承;李航;贾立军;
为了解吉林省马弓形虫感染情况,本试验共采集辽源、白城、通化和吉林市等地血液样本120份,利用血液基因组提取试剂盒和PCR技术对弓形虫B1基因进行检测。结果表明,弓形虫总体阳性率为9.17%(11/120)。调查的4个地区中辽源阳性率最高14.30%(5/35),其次为白城10.00%(3/30)、通化8.00%(2/25)、吉林市3.30%(1/30),除白城和通化地区间差异不显著(P>0.05)外,其他各地区间差异显著(P<0.05);散养马阳性率为11.10%(10/90),规模化养殖马阳性率为3.30%(1/30),差异显著(P<0.05);母马弓形虫阳性率为9.47%(9/95),公马弓形虫阳性率为8.00%(2/25),性别间差异不显著(P>0.05)。结果证明,吉林省马感染弓形虫的情况普遍存在。本次调查为吉林省马弓形虫病的有效防控提供了科学依据。
2020年09期 v.40;No.285 1791-1795页 [查看摘要][在线阅读][下载 1129K] [下载次数：313 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ]
- 陈小风;崔嘉;杨新宇;吴峰洋;陈宝江;
旨在研究不同浓度硫化氢对断奶仔猪生长性能及免疫性能的影响。选取平均体质量为(11.25±1.01) kg的断奶仔猪(杜×长×大)24头,随机分为4个处理组,每组6个重复,每个重复1头仔猪。将各个处理组分别置于环境控制仓内,硫化氢含量控制为0,5,10,15 mg/m~3。预试期7 d,正式期28 d。每周记录采食量及体质量,试验结束后取前腔静脉采血并分离血清,ELISA法测定IgA、IgM、IgG、BAX、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、MDA和SOD等指标。结果显示:与对照组相比,各处理组仔猪日增质量极显著降低(P<0.01);处理组腹泻率增高、粪便评分降低;粗蛋白的表观消化率显著下降(P<0.05);粗纤维、粗脂肪、总能、钙和磷的表观消化率均低于对照组(P>0.05);处理组IgG与IgM含量存在降低趋势(P>0.05),其中试验3组血清中IgA含量显著降低(P<0.05);试验组IL-4和IL-6含量升高,且试验3组显著升高(P<0.05);TNF-α略有降低(P>0.05);处理组Bcl-2含量升高,其中试验2、3组显著增加(P<0.05);各试验组Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9含量下降,试验3组Caspase-8与对照组相比差异显著(P<0.05);试验2组Caspase-9显著下降(P<0.05);处理组BAX含量有下降趋势(P>0.05);处理组MDA含量升高,且试验3组显著升高(P<0.05);SOD活性降低,且试验2组极显著降低(P<0.01)。结果表明硫化氢胁迫导致仔猪生长性能下降、免疫性能受损并且引发机体发生炎症反应。
2020年09期 v.40;No.285 1796-1802页 [查看摘要][在线阅读][下载 890K] [下载次数：121 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：1 ] - 万方;钟高龙;宁芷君;伍少峰;蒋璇璇;唐兆新;李英;潘家强;胡莲美;
为了研究三氧化二砷(As_2O_3)对雄性小鼠生殖系统的影响,将40只6周龄雄性小鼠随机分为4组,以0,3,6,9 mg/kg的剂量连续4周皮下注射As_2O_3溶液,观察睾丸和附睾病理变化,检测精子活力、血浆和睾丸中砷含量、睾酮含量、抗氧化指标(MDA、GSH-Px)、生殖相关标志性分子AR、GPx5和Miwi基因表达以及Miwi定位表达。结果显示,As_2O_3处理组中睾丸生精管畸形,管内生精细胞排列紊乱,附睾管内精子和生精细胞显著减少。随着As_2O_3浓度的增加,精子活力下降,血浆和睾丸中的砷含量增加,睾酮水平降低。在血浆和睾丸中,MDA和GSH-Px含量在6和9 mg/kg As_2O_3组显著增加(P<0.05)。生殖相关标志性分子AR、GPx5和Miwi的表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)。Miwi在睾丸初级精母细胞中的定位表达随着As_2O_3剂量的增加明显降低。上述结果表明,As_2O_3诱导小鼠发生氧化应激,阻碍了小鼠的精子成熟和精子发生,导致生殖毒性。
2020年09期 v.40;No.285 1803-1809页 [查看摘要][在线阅读][下载 6817K] [下载次数：321 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：1 ] - 周佳桦;张雨蓓;张松彬;张闯;闵雯嫣;赵鸿雁;刘宗平;顾建红;
旨在探究β-catenin在lα,25-(OH)_2D_3调控小鼠体外破骨细胞(osteoclast,OC)形成中的作用。体外诱导小鼠OC形成,添加1α,25-(OH)_2D_3观察其对OC形成及β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响;敲低β-catenin进一步观察1α,25-(OH)_2D_3对OC形成的影响。结果显示,1α,25-(OH)_2D_3极显著(P<0.01)抑制体外培养小鼠OC形成和骨吸收活性。敲低β-catenin,OC数量及OC形成标志物基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白和激活T-细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells,cytoplasmic 1,Nfatc1)mRNA表达显著(P<0.05)升高。1α,25-(OH)_2D_3可促进OC形成过程中β-catenin基因Ctnnb1 mRNA的表达,但敲低β-catenin基因,1α,25-(OH)_2D_3仍可抑制OC形成。试验表明,β-catenin可抑制体外培养OC形成,但对1α,25-(OH)_2D_3抑制OC形成无影响。
2020年09期 v.40;No.285 1810-1816页 [查看摘要][在线阅读][下载 5912K] [下载次数：87 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ]
- 赵园园;赵成刚;安清明;武渊勋;孟金柱;
为寻找牛卵泡颗粒细胞(GCs)凋亡的关键调控因子,阐明单胎动物卵泡闭锁调控机理,本研究对奶牛优势卵泡与从属卵泡GCs深度测序,筛选卵泡发育相关的下调基因。选取健康荷斯坦奶牛,屠宰后,分别采集卵巢上正常发育的最大卵泡(8～10 mm)与第二大卵泡(5～8mm),并结合雌激素/孕激素确定卵泡优势与否,优势卵泡(DF):E_2/P>1;从属卵泡(SF)E_2/P<1。分别刮取GCs,提取总RNA并建库,Illumina测序,将获得序列与牛Refseq数据库比对后,利用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对其中表达下调的基因进行GO和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。测序共获得32 346个基因,其中194个在DF中表达显著上调,502个表达下调;GO分析结果显示,这些下调基因的生物学功能共分为3大类104组,其中生物学过程相关基因占61.5%,细胞组分有关基因占25.0%,分子功能相关基因占13.5%;KEGG信号通路分析,共发现5条通路,其中基因富集最为显著的是癌症通路;从下调基因中筛选出4个在牛卵泡发育过程中可能会起抑制作用的基因,QRT-PCR结果显示,PPP1R14A、QRFPR和EGR1在DF和SF中的表达趋势与深度测序结果一致,OLA1在DF和SF中的表达趋势与深度测序结果正好相反,但差异不显著。本研究筛选出的4个表达下调基因可能是牛卵泡发育过程中抑制卵泡发育的候选基因。
2020年09期 v.40;No.285 1825-1831页 [查看摘要][在线阅读][下载 4792K] [下载次数：140 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 于佳楠;王晶;陈贝妮;韩金恒;候佳妮;王健;姜云瑶;李朝辉;许春彦;牛淑玲;
旨在探讨复方中草药对芦花鸡生长性能及肠道菌群多样性的影响。随机将600只1日龄芦花鸡雏分为Ⅰ、Ⅱ两组,每75只为1个重复组,每组4个重复。Ⅰ组饲喂基础日粮,Ⅱ组饲喂在Ⅰ组基础日粮中添加含有0.3%复方中草药,试验期为84 d。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组的平均日增质量提高12.07%(P<0.01),饲料转化率改善7.75%(P<0.05);Ⅱ组尿素、甘油三酯水平分别降低10.40%和3.49%,生长激素水平提高9.80%(P>0.05);Ⅱ组螺旋菌门、变形菌门和瘤胃球菌属丰度分别降低10.84%(P>0.05),17.28%和69.87%(P<0.05),考拉杆菌属丰度提高3.50%(P>0.05)。综上,该复合中草药添加剂不仅可以提高芦花鸡平均日增质量,改善饲料利用率,而且在一定程度上提高芦花鸡血清中生长激素水平以及优化芦花鸡肠道菌群结构组成。
2020年09期 v.40;No.285 1832-1835页 [查看摘要][在线阅读][下载 792K] [下载次数：571 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：34 ] |[阅读次数：1 ] - 周志楠;陈祥;敖叶;洪磊;韦仕南;
以单、多羔黔北麻羊为试验对象,采用PCR法扩增克隆获得黔北麻羊CTSB、CTSD基因CDS区序列,生物信息学方法分析黔北麻羊CTSB、CTSD的理化性质、蛋白质高级结构、亚细胞定位情况和信号肽位点,并进行氨基酸同源性分析构建系统进化树;应用qRT-PCR法对目的基因在单、多羔黔北麻羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢5个性腺组织中的表达量进行差异分析。结果表明:黔北麻羊CTSB、CTSD基因编码序列全长为1 008和1 239 bp,共编码335和412个氨基酸。其蛋白相对分子质量分别为36 780和44 590,理论等电点为5.65和7.03,不稳定系数为65.16和37.82。CTSB、CTSD蛋白二级结构均主要由无规则卷曲构成;三级结构预测结果与二级结构一致,且CTSB蛋白属于亲水性蛋白,信号肽剪切位点位于第17～18号氨基酸,亚细胞定位发现CTSB蛋白有66.7%的可能定位于细胞外;而CTSD属于疏水性蛋白,信号肽剪切位点位于第22～23号氨基酸,亚细胞定位表明其有44.4%的可能定位于细胞外(包括细胞壁)。与其他动物相比,黔北麻羊CTSB、CTSD编码氨基酸序列与绵羊的亲缘性最近。qRT-PCR结果显示,CTSB、CTSD基因在单、多羔黔北麻羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢5个性腺组织中均有表达,且在卵巢中的表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),CTSB基因mRNA在多羔黔北麻羊垂体、子宫中的表达量极显著高于单羔黔北麻羊(P<0.01),CTSD基因mRNA在多羔黔北麻羊垂体、输卵管、卵巢中的表达量极显著高于单羔黔北麻羊(P<0.01)。本试验揭示了CTSB、CTSD基因在单、多羔黔北麻羊的表达差异并初步分析了其生物学功能,为进一步探究CTSB、CTSD基因的功能与调控机理奠定了基础。
2020年09期 v.40;No.285 1836-1846页 [查看摘要][在线阅读][下载 4849K] [下载次数：202 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：1 ] - 杜小龙;张乐超;赵丽杰;乔宁;高明;李兰会;李祥龙;
旨在探究催乳素受体(PRLR)基因不同剪切体表达对不同胚龄快慢羽太行鸡主翼羽和覆主翼羽生长影响。采集18和19胚龄太行鸡肝脏DNA、左翅皮肤组织RNA、右翅主翼羽和覆主翼羽,测量主翼羽和覆主翼羽长,通过PCR鉴定鸡胚羽型和性别、检测PRLR基因不同剪切体在鸡翅皮肤组织的表达变化,分析羽型、胚龄和性别对主翼羽和覆主翼羽长影响和PRLR剪切体表达变化,明确PRLR基因剪切体类型表达量与快慢羽鸡主翼羽和覆主翼羽长间关系。结果显示性别对主翼羽和覆主翼羽的长度均没有显著影响(P>0.05),但胚龄和羽型对两种羽毛长度均有显著影响(P<0.05)。18胚龄时快羽鸡主翼羽和覆主翼羽长显著长于慢羽鸡(P<0.05),19胚龄时快慢羽鸡间主翼羽长度仍然保持显著差异(P<0.05),而覆主翼羽的长度显著差异消失(P>0.05);18胚龄两种羽型鸡的主翼羽均长于覆主翼羽(P<0.05),而19胚龄慢羽鸡的主翼羽和覆主翼羽间长度差异消失(P>0.05)。鸡胚皮肤组织共发现PRLRS1和PRLR_(S2)两种剪切体,胚龄和性别对二者的表达均没有显著影响(P>0.05),羽型影响PRLR_(S2)的表达(P>0.05),19胚龄时慢羽PRLR_(S2)表达显著高于快羽(P<0.05)。本试验推断快慢羽太行鸡18胚龄时主翼羽与覆主翼羽的长度差异,以及两种羽毛长度在快慢羽鸡间的差异已经凸现,但19胚龄慢羽鸡覆主翼羽生长速度增加,两种羽型鸡的覆主翼羽长度差异以及慢羽鸡两种羽毛间长度差异消失;慢羽鸡19胚龄PRLR_(S2)高表达,可能促进了其覆主翼羽生长。该研究结果为揭示快慢羽鸡主、覆主翼羽长度差异的形成以及PRLR_(S2)在调控羽型形成作用机制提供数据支持和理论参考。
2020年09期 v.40;No.285 1847-1853页 [查看摘要][在线阅读][下载 995K] [下载次数：127 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 田发益;刘贵芳;武俊喜;
放牧与舍饲环境下,因养分不同,会引起家畜相应生理机能和代谢机理变化。探究西藏彭波半细毛羊在两种环境下代谢通路的差异情况,为放牧条件下藏系绵羊合理补饲和全价舍饲养殖饲草配方提供可行的理论和方法。采用非靶向代谢组学方法,测定放牧与舍饲环境下彭波半细毛羊血清中代谢物的沉积量与变异关系,与人类代谢组学数据库(HMDB)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库进行比对,找出与之相对应的代谢通路,并分析其原因。结果发现24种代谢物存在显著性差异(P<0.05),其中放牧组血清沉积代谢物肌醇-1-磷酸盐、赖氨酸、非对称二甲基精氨酸、鸟氨酸-1,5-丙酰胺和鸟氨酸差异显著(P<0.01);舍饲组血清沉积代谢物3-乙基苯酚、3-羟基丁酸、4-羟基脯氨酸和多聚谷胺酸差异显著(P<0.01)。与24种显著代谢物关联的代谢通路有23种,两种模式存在8种显著差异的代谢通路(P<0.05)。采用原始数据差异性、Holm-Bonferroni差异性、错误发现率(FDR)及通路拓扑等分析法,发现低蛋白饲料主要影响放牧组的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成代谢通路,对精氨酸和鸟氨酸代谢通路也存在影响,即蛋白合成与机体信使传导受到阻滞。对舍饲组的丙酮酸代谢、糖酵解和糖质新生代谢通路产生影响,即能量饲料供应过剩。
2020年09期 v.40;No.285 1854-1863页 [查看摘要][在线阅读][下载 7331K] [下载次数：529 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：1 ]