- 岳慧贤;张艳艳;陈腾;杨金金;杨金梅;郭晓盼;张菲;张守峰;王颖;韩栒;扈荣良;
人工合成猪GM-CSF基因,以pET32a质粒构建重组表达载体,转化Rosetta菌以IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot分析证实其以包涵体形式表达,His标签融合蛋白大小约38 kDa。以含10μg/L重组猪GM-CSF的培养基培养猪骨髓源细胞培养7 d,细胞形态变大变圆,漂浮细胞呈现树突状形态,贴壁细胞呈现典型巨噬细胞形态,刺激分化作用显著;同时,以此分化成熟的骨髓巨噬细胞培养非洲猪瘟病毒,滴度可提高3～30倍。因此,本研究获得的重组猪GM-CSF能有效提高病毒培养产量,可用于非洲猪瘟疫苗的生产。
2021年05期 v.41;No.293 841-846页 [查看摘要][在线阅读][下载 1188K] [下载次数：307 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 韩玉;王涛;潘力;孙茂文;周萍萍;王冰;王翌;罗玉子;仇华吉;孙元;
为用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CD2v基因功能研究及区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株,本研究根据ASFV中国流行株(MK333180.1)的CD2v基因序列设计了1对特异性引物和探针,经过条件优化建立了一种以ASFV CD2v基因为靶标的能够鉴别ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.6×10~1～1.6×10~8拷贝/μL时,线性关系良好,线性相关系数R~2为0.998;该方法可以特异性检测ASFV,不与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型发生交叉反应;最低检测限为16拷贝/μL,比常规PCR的敏感性高出3个数量级;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%;能够有效地区分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株;该方法与本实验室建立的针对ASFV p72基因的荧光定量PCR方法在检测临床样品时无统计学差异且符合率高。本研究所建立的TaqMan荧光定量PCR方法为ASFV的快速检测提供了新靶标,同时也为ASFV CD2v基因功能的研究、野毒株与CD2v基因缺失毒株的鉴别提供了有力的技术支持。
2021年05期 v.41;No.293 847-852页 [查看摘要][在线阅读][下载 1012K] [下载次数：715 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：12 ] |[阅读次数：0 ] - 凌蒙蒙;孙艺学;邓效禹;王杨;张鹏举;丛彦龙;
gE蛋白是鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染和gE基因缺失疫苗免疫的首选靶标。本研究利用大肠杆菌表达系统获得了可溶性表达的gE_(37～243)蛋白,并以纯化的gE_(37～243)蛋白为包被抗原建立了检测PRV gE抗体的间接ELISA方法。结果显示,该方法的敏感性和特异性分别为93.33%和93.75%,批内和批间变异系数均低于10%,与商品化试剂盒的符合率为92.00%。结果表明,本研究方法能够满足鉴别PRV野毒感染和疫苗免疫的需求。
2021年05期 v.41;No.293 853-857页 [查看摘要][在线阅读][下载 555K] [下载次数：411 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 孔令昊;苗信永;赵士杰;李闻;徐朋丽;孙杨扬;崔志莹;夏平安;张宜娜;吴斌;
为了解近几年河南省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)的遗传进化情况,本研究对2018-2020年采自河南省部分地区的307份病料样品进行双重PCR检测,并进行gC、gE全基因组克隆和序列分析。结果显示307份样品中有14份呈阳性,其阳性率为4.56%,且从14份阳性样品中分别克隆了gC、gE全基因组。核苷酸序列分析结果显示,gC基因之间的核苷酸同源性为99.6%～100.0%,与国内变异毒株HeN1-2012等的核苷酸同源性为99.8%～100.0%,与国外经典毒株Bartha等的核苷酸同源性为94.7%～95.8%;gE基因之间核苷酸同源性为98.7%～100%,与国内变异毒株HeN1-2012等的核苷酸同源性为98.7%～99.9%,与国外经典毒株Bartha等的核苷酸同源性为96.6%～97.7%。氨基酸序列对比结果显示,本研究测序14株PRV与国内经典毒株Ea株相比,gC基因有3处氨基酸突变(N34T、K99E、E194G),gE基因存在自6处氨基酸突变(G54D、P403A、V450I、496D(插入)、G510S、S518P);与国内变异毒株HeN1-2012相比,均没有发生氨基酸位点突变;与国外经典毒株Bartha等经典毒株相比gC全基因均存在第63位点处连续插入7个氨基酸(AAASTPA),并且存在30处氨基酸的替换,gE全基因存在23处氨基酸变异位点。氨基酸序列分析显示本研究测序14株PRV与国内变异毒株HeN1-2012处于同一分支,亲缘关系最近,且这些特征性变异位点可作为分子诊断依据,为河南省猪场PRV的净化提供了参考依据。
2021年05期 v.41;No.293 858-864页 [查看摘要][在线阅读][下载 1398K] [下载次数：239 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 李丽;赵康;张媛;王红琳;罗青平;邵华斌;潘兹书;温国元;
猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。为研发新型PCV2疫苗,采用反向遗传操作技术,以耐热低毒的新城疫病毒TS09-C株为载体,将PCV2主要免疫原蛋白Cap以单独编码框的方式插入至TS09-C株的基因P和M之间,为增强Cap蛋白在载体内的高效表达及细胞外分泌,将Cap基因的核定位信号序列替换为组织纤溶酶原激活物信号肽序列(tPAs)。通过病毒拯救获得了重组新城疫病毒rTS-tPAs-Cap/N。Western blot和间接免疫荧光试验证实,重组病毒可在BHK-21细胞中高效表达Cap蛋白。生物学特性试验表明重组病毒保持了亲本TS09-C株的耐热、低毒和高细胞增殖特性,重组病毒免疫小鼠后可诱导机体产生较高的PCV2抗体水平。本研究为研发耐热、安全、免疫性好的PCV2疫苗奠定了良好的工作基础。
2021年05期 v.41;No.293 865-871页 [查看摘要][在线阅读][下载 973K] [下载次数：258 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 徐荣艺;石俊超;张竞;高蕊;李姿;贺文琦;高丰;
为阐明猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)感染后小鼠脑内星形胶质细胞的活化情况,本研究通过滴鼻途径将PHEV接种BALB/c小鼠,分别运用qRT-PCR、Western blot和间接免疫荧光方法检测感染后不同时间点小鼠脑组织内星形胶质细胞特异性标志物GFAP的表达情况。结果表明,与正常对照组小鼠相比,接种PHEV后3 d即可检测到GFAP表达水平显著升高,并且GFAP的表达量随着感染时间延长逐渐增加。间接免疫荧光结果发现星形胶质细胞数量增加,分布集中,同时细胞体积增大,突起变多,证明星形胶质细胞在PHEV感染的小鼠脑内发生了活化。上述结果可为后期深入开展PHEV所致神经炎性损伤的机制研究奠定基础。
2021年05期 v.41;No.293 872-876页 [查看摘要][在线阅读][下载 3726K] [下载次数：196 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 王政;解长占;于成东;于桐;李亭玉;李金凤;孟媛;鲁会军;金宁一;张雪梅;
为监测广西地区猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)的流行和变异情况,本研究从广西省某猪场采集样本成功分离获得PRRSV毒株并命名为Y12018,并参考扩增全长所需的10对特异性引物对其全基因组序列分段扩增后连接,为进一步鉴定Y12018毒株,将Nsp2与GP5等序列分别与参考毒株进行对比,分析该分离株与国内外典型毒株的遗传进化关系从而探究其基因组来源。结果显示,Y12018毒株基因组全长为15 017 bp(除去polyA尾),与NADC30毒株遗传关系最为接近,全基因组同源性为94.4%;Nsp2同源性为96.8%,与NADC30相比缺失的2个氨基酸,对应VR-2332为587～588位点;GP5同源性为93.5%,对应氨基酸序列有31个位点发生改变;其余各开放阅读框的同源性为92.9%～97.1%;遗传演化分析结果表明分离株Y12018属于类NADC30毒株。
2021年05期 v.41;No.293 877-882页 [查看摘要][在线阅读][下载 1827K] [下载次数：318 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 李金斗;丁佳欣;冯嘉轩;陈铭桦;张頔;邵亚男;徐小洪;丁壮;
m6A甲基化修饰广泛存在于真核细胞和病毒RNA中,在病毒感染过程及宿主细胞抗病毒反应中扮演重要角色,然而m6A修饰在新城疫病毒复制过程中发挥的功能并不清楚。本研究发现新城疫病毒(NDV)感染后显著增加HD11细胞RNA的整体甲基化水平,抑制甲基转移酶METTL3的表达而促进甲基转移酶METTL14的表达。进一步研究发现,抑制m6A甲基化修饰显著促进NDV NP基因的mRNA转录及翻译,过表达甲基转移酶METTL3和METTL14明显抑制NDV的复制,表明m6A甲基化修饰在NDV复制过程中起负调控作用。
2021年05期 v.41;No.293 883-888页 [查看摘要][在线阅读][下载 2650K] [下载次数：266 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 刘月月;侯瑞卿;张盼涛;段佳蕾;王同燕;郭丽霞;盛东北;袁月;刘武杰;田克恭;
为研究鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(N7a株+M41株+SZ株)(以下简称"三联苗")的应用效果,使用14日龄AA肉鸡和210日龄蛋鸡进行安全性和有效性研究。安全性研究结果表明,三联苗免疫肉鸡后鸡群精神、采食等状况无任何异常,注射部位无溃烂、肿胀、发炎等症状,各时间点体质量与对照组无明显差异,出栏当日疫苗完全吸收;三联苗免疫蛋鸡后鸡群无任何不良反应,产蛋率与对照组无明显差异。有效性研究中,肉鸡免疫后抗体HI效价持续升高,出栏当日NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价达到高峰,分别为8.8 log_2、6.7 log_2、9.3 log_2;攻毒保护结果表明,免疫后21 d,三联苗能对新城疫和禽流感(H9亚型)提供完全保护。蛋鸡免疫后21 d NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价达到最高,分别为11.6 log_2,8.9 log_2,12.1 log_2,而后逐渐降低,但免疫后6个月仍然保持在较高的水平。本研究表明,三联苗免疫肉鸡和蛋鸡安全、有效。
2021年05期 v.41;No.293 889-894页 [查看摘要][在线阅读][下载 989K] [下载次数：482 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 杜东颖;黄晓静;刘武杰;段佳蕾;盛东北;田辉;王孟月;姚延丹;张盼涛;田克恭;
为了评价以禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白为免疫原制备精制卵黄抗体的免疫效果,本研究使用重组大肠杆菌BL21(DE3)-Fiber-2株诱导表达禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白,蛋白纯化后制备免疫原,免疫产蛋鸡收获高免蛋,经提纯获得的精制卵黄抗体AGP效价达1∶8;将精制卵黄抗体注射SPF鸡进行免疫效果评价。结果表明,精制卵黄抗体经肌肉或皮下注射SPF鸡,注射后7d内可100%保护鸡群抵抗禽腺病毒(C种,4型)强毒株的攻击,另外强毒株人工感染后24 h内肌肉或皮下注射抗体1.0 mL/只,可为感染鸡提供90%～100%的保护。本研究表明,以原核表达制备的禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白为免疫原制备的精制卵黄抗体免疫效果较为理想,为后续抗体的临床应用提供了技术参考,并为该病的防控提供了新的思路。
2021年05期 v.41;No.293 895-899页 [查看摘要][在线阅读][下载 267K] [下载次数：344 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 高娜;童剑军;何川川;张雪萍;杨勇飞;李有文;
为进一步研究山羊痘病毒毒力因子KLP1,了解其生物学功能,本试验构建了羊皮肤组织酵母cDNA文库及GTPV KLP1蛋白基因的诱饵质粒,并做了质粒的自激活检测。采用酵母双杂交方法,从羊皮肤组织酵母cDNA文库中筛选出与KLP1蛋白相互作用的蛋白,结果成功构建了羊皮肤组织cDNA文库,容量为1.05×10~7 CFU,成功构建pGBKT7-KLP1诱饵质粒,且在酵母双杂交系统中没有毒性和自激活作用;酵母双杂交筛选出与KLP1蛋白互作的蛋白克隆25个,经过测序比对合并得9种蛋白,对其进行LacZ回转验证和共定位试验验证,证实NOTCH1蛋白与KLP1蛋白具有特异的相互作用。本试验为阐明GTPV毒力因子KLP1的生物学特征及其作用机制提供参考。
2021年05期 v.41;No.293 900-904+910页 [查看摘要][在线阅读][下载 1677K] [下载次数：245 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 郝镯;张珊珊;李楠;田多;李吉平;孟轲音;万忠海;穆玉堂;李忠义;王承宇;
为建立一种新型、稳定、可普遍应用的诊断犬瘟热病毒(CDV)的方法,将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)与SYBR GreenⅠ相结合,根据CDV N基因序列中同源性相对较高的保守区设计1套标有生物素Biotin的特异性引物和1条标记dSpacer、C3 Spacer的特异性探针,优化反应条件和体系,分析其灵敏性及特异性,最后建立一种可以进行临床应用的,特异性检测CDV的RPA-SYBR GreenⅠ方法。结果显示,成功构建检测CDV的RPA-SYBR GreenⅠ方法,此方法的最佳反应条件为实验人员闭合手掌中孵育10 min,引物与探针的最佳比例为2∶1。该方法的最低检测下限为1×10~1～1×10~0 TCID_(50)/mL,能够特异地检测出CDV。应用本方法检测临床样品的结果与ELISA、RT-PCR方法的结果一致。结果表明,本试验所建立的CDV RPA-SYBR GreenⅠ检测方法特异性强,灵敏度高,操作简单,可应用于临床。
2021年05期 v.41;No.293 905-910页 [查看摘要][在线阅读][下载 2633K] [下载次数：403 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 张晓亮;马水燕;郝华芳;陈胜利;颜新敏;马丽娜;刘永生;储岳峰;
为筛选出山羊传染性胸膜肺炎疫苗制备中抗原产量高且成本低的培养基,本试验将山羊支原体山羊肺炎亚种M1801株和M1601株接种于含20%马血清的改良Thiaucourt’s肉汤(MTB)和新研制的含5%马血清的培养基(HF3),在120 h内监测其pH值、颜色变化单位(color change units, CCU)和菌体蛋白浓度的变化,绘制相应曲线。结果表明,山羊支原体山羊肺炎亚种用HF3培养时pH值下降更慢,2个菌株在HF3培养基中的CCU计数均高于MTB培养基,且高滴度维持时间更长,菌体的蛋白浓度也略高于MTB培养基。结果提示山羊支原体山羊肺炎亚种在HF3培养基中产量更高,较MTB具有更好的效果,且血清浓度低,成本更低廉,为山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗的大批量生产奠定了基础。
2021年05期 v.41;No.293 911-914+919页 [查看摘要][在线阅读][下载 1132K] [下载次数：187 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 张林吉;迟兰;李心海;王玉燕;房超;任士飞;
以江苏徐州地区主要流行的印第安纳沙门菌、阿贡纳沙门菌和鸭沙门菌3株鸭源沙门菌为研究对象,采用高密度发酵制备多价油乳剂灭活疫苗,检验疫苗性状并对疫苗免疫后雏鸭血清抗体水平的消长规律和淋巴细胞的活性进行检测,评价疫苗对雏鸭的免疫保护效果,以期制定出合理的免疫程序。结果显示,制备的疫苗为油包水剂型,物理性状稳定,无菌检测合格。雏鸭免疫抗体水平监测结果显示,单次免疫,抗体水平在免疫后3周达到高峰;多次免疫,抗体水平在免疫后5周达到高峰,7周后依然维持较高水平。E玫瑰花环试验检测T淋巴细胞数量,免疫组明显高于对照组。动物免疫试验结果显示,制备的三价油乳剂灭活疫苗可以有效抵抗强毒菌株的攻击,动物保护率达到87%以上。本研究制备的鸭源沙门菌多价油乳剂灭活疫苗性状稳定,免疫效果好,能有效抵抗强毒菌株攻击,为鸭沙门菌病的预防提供有效的防控生物制品。
2021年05期 v.41;No.293 915-919页 [查看摘要][在线阅读][下载 200K] [下载次数：268 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 王佳楠;汪德会;李攀;王远兰;赵宗铃;彭远义;
为探究多杀性巴氏杆菌在厌氧条件下出现溶血现象的原因,设计以牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2为模式菌株,对其在有氧和厌氧环境培养条件下所得菌体进行TMT蛋白组学分析,结合生物信息学分析筛选潜在溶血因子,同时用qRT-PCR及Western blot方法验证蛋白组结果。结果显示,蛋白组学定量检测到1 603个蛋白,其中厌氧组较有氧组上调表达164个,下调表达282个,差异蛋白主要参与代谢及合成等生物进程、细胞和膜等细胞组分、催化活性和结合活性等分子功能;mRNA水平及蛋白水平的验证结果与蛋白组测定结果基本一致;基于蛋白注释、差异表达倍数、蛋白结构域、亚细胞定位和基因家族主要功能等共筛选到11个假定溶血候选因子,为多杀性巴氏杆菌溶血机制研究提供了理论依据。
2021年05期 v.41;No.293 920-928+956页 [查看摘要][在线阅读][下载 3214K] [下载次数：311 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 杨怡;段丽君;张红丽;周前进;陈学秋;杜爱芳;
捻转血矛线虫微粒体氨肽酶H11是有效的疫苗候选抗原,其重组蛋白免疫保护效果可能与基因亚型相关。为分析H11亚型基因的序列结构及启动子活性,本研究扩增并鉴定了H11-1、H11-2亚型基因的开放阅读框(2 937,299 bp),发现其与已知H11 (H11-3)、H11-4亚型氨基酸序列高度同源,具有保守的糖基化位点、跨膜区及微粒体氨肽酶活性中心锌指基序。分段扩增获得了H11-1、H11-2、H11-4亚型基因DNA序列(11 698,17 995,19 804 bp),比对分析发现,与H11(H11-3)基因结构相似,H11-1、H11-2亚型基因均含25个外显子和24个内含子,通过典型的GT…AG结构剪接,对应的外显子大小基本一致,内含子大小各异,同源性低;推测各亚型不是由同一基因选择性剪接形成,但剪接模式相同。运用基因步移技术扩增鉴定了H11-1、H11-2、H11-4亚型基因5′侧翼区(4 606,3 465,2 361 bp),利用pPD95.77载体构建了重组表达载体,通过显微注射将其导入秀丽线虫观察其启动转录活性,结果表明H11-4 5′侧翼区可启动GFP在秀丽线虫除胚胎以外的各时期表达,且表达集中于虫体肠道起始和末端;未检测到H11-1或H11-2 5′侧翼区启动的GFP表达,推测其转录活性或GFP表达较弱。本研究为后续探明H11基因各亚型生物学功能、参与免疫保护机制及高效重组疫苗研究奠定了基础。
2021年05期 v.41;No.293 929-936页 [查看摘要][在线阅读][下载 1552K] [下载次数：139 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 陈梦阁;李新;张旭;王晓岑;张西臣;宫鹏涛;李建华;
探究新孢子虫感染对小鼠腹腔巨噬细胞鸟苷酸结合蛋白(mGBPs)表达的影响,以及mGBP5在新孢子虫感染中的作用。将新孢子虫速殖子感染小鼠腹腔巨噬细胞后,通过RT-PCR和Western blot检测,筛选出上调表达的mGBPs,构建pcDNA3.1-mGBP5真核表达载体并转染293T细胞,再通过Western blot验证mGBP5蛋白的过表达,最后感染新孢子虫并采用荧光定量PCR检测虫体数量。结果显示,新孢子虫感染引起mGBP1-mGBP11 mRNA表达水平升高,且mGBP5蛋白表达水平显著升高,并可诱导细胞质内散在分布的mGBP5向新孢子虫的纳虫泡膜聚集;成功构建pcDNA3.1-mGBP5真核表达载体并能够在293T细胞中表达;与空载体组相比,细胞中过表达mGBP5可显著减少胞内新孢子虫的数量。结果表明,新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞会导致mGBP5表达上调,并靶向新孢子虫的纳虫泡膜,从而起到抑制新孢子虫增殖的作用。
2021年05期 v.41;No.293 937-943页 [查看摘要][在线阅读][下载 2340K] [下载次数：166 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 冯爽;张双翼;李茜如;赵佳敏;巩志国;刘博;
子宫内膜修复和前列腺素F_(2α)(PGF_(2α))分泌之间存在正相关关系,但PGF_(2α)在子宫内膜修复中发挥的具体作用目前仍未知。本试验通过体外培养奶牛子宫内膜组织,研究激活PGF_(2α)受体(prostaglandin F_(2α) receptor, PTGFR)对参与子宫内膜修复的一系列生长因子表达的影响。结果显示,在使用氟前列醇(fluprostenol)激活PTGFR后,子宫内膜组织中结缔组织生长因子(CTGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGFA)的mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)。此外,子宫内膜组织中能够代表细胞发生增殖的增殖细胞核抗原(PCNA)水平也出现显著上升(P<0.05)。结果表明,PGF_(2α)-PTGFR通路的激活可通过诱导生长因子的表达对奶牛子宫内膜的生长起到促进作用。
2021年05期 v.41;No.293 968-974页 [查看摘要][在线阅读][下载 2029K] [下载次数：231 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 常振宇;董海龙;李家奎;吴庆侠;
为成功分离、培养高原肉鸡原代和传代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),探讨低氧条件下对其增殖的影响,本试验随机分为2组造模:常氧对照组(N)和低氧组(H),采用组织贴块法在常氧和低氧条件下体外培养肉鸡的肺动脉平滑肌细胞,用形态学和免疫组化的方法对平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(ACTA-2)表达进行鉴定,并用CCK-8法检测PASMC增殖情况。结果表明:培养后第4天PASMCs在显微镜下呈现特有的"峰-谷"状,细胞呈三角形或长梭形,细胞核位于正中央,用鼠抗ACTA-2单克隆抗体为一抗经免疫组化染色可见胞浆内有棕红色的细丝,PASMCs在常氧下的增殖能力显著高于低氧(P<0.05)。说明通过组织贴块法可高效分离、获得高原肉鸡PASMCs,并为PASMCs的体外研究工作提供了简单有效的培养方法。
2021年05期 v.41;No.293 975-979页 [查看摘要][在线阅读][下载 2976K] [下载次数：200 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 刘颖;柴丽娟;黄菊阳;王琴;宋蕾;周昆;李云章;
为了研究朝藿定A对原代骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨细胞分化的机制,本试验采用正常小鼠骨髓来源的间充质干细胞,通过观察朝藿定A对骨髓间充质干细胞成骨分化、成脂分化和矿化能力的影响,应用ELISA技术,研究其抗骨质疏松作用及相关分子机制。结果显示,朝藿定A给药3 d后,成骨诱导后的BMSCs分泌了更多碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP),在朝藿定A给药14 d后,矿化结节显著增多,朝藿定A给药10 d后,朝藿定A低剂量组成脂分化的程度没有明显变化,而高剂量组成脂分化较对照组显著降低。BMSCs经成骨诱导及朝藿定A给药7 d后,给予0.01μmol/L朝藿定A时,上清中骨保护素(osteoprotegerin, OPG)水平显著升高,给予0.1 nmol/L朝藿定A时,成骨细胞表达核转录因子(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)水平呈上升趋势;而给予1,100μmol/L朝藿定A时,RANKL水平呈下降趋势。从OPG/RANKL的结果来看,给予0.1 nmol/L朝藿定A时OPG/RANKL值较对照组显著升高。说明朝藿定A可以促进BMSCs向成骨细胞分化并抑制其成脂分化,可以促进成骨细胞矿化并提高成骨细胞OPG/RANKL水平从而发挥骨保护作用。
2021年05期 v.41;No.293 980-984+991页 [查看摘要][在线阅读][下载 2004K] [下载次数：195 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 薛才华;武强;王梦杰;刘嘉华;张龙飞;张家玮;拉忠花;吴华;柴沙陀;
探讨黑枸杞花青素对脂多糖(LPS)作用下的小鼠Raw264.7细胞的影响及作用机制。体外培养小鼠巨噬细胞Raw264.7,脂多糖作用于小鼠巨噬细胞Raw264.7诱导其损伤建造炎症模型,细胞分为对照组、花青素组、LPS组、花青素+LPS组。ELISA检测各组细胞中IL-6、IL-10、TNF-α和INF-γ的含量的变化;RT-PCR测定相关因子mRNA表达;Western blot法检测各组中TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平。黑枸杞花青素可以抑制LPS诱导的细胞促炎因子IL-6、TNF-α和INF-γ的mRNA的表达(P<0.05),同时能不同程度的抑制细胞上清中IL-6、TNF-α和INF-γ的分泌量(P<0.05);除此之外,经黑枸杞花青素处理后,LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞中,TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平极显著降低(P<0.01)。黑枸杞花青素可抑制LPS诱导的小鼠Raw264.7细胞炎症,其机制可能与调节TLR4/NF-κB信号通路有关。
2021年05期 v.41;No.293 985-991页 [查看摘要][在线阅读][下载 1021K] [下载次数：895 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：0 ] - 李云飞;李聪宜;杨宇宸;冯献程;杜希良;李心慰;李小兵;王哲;宋玉祥;刘国文;
亚急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis, SARA)奶牛存在系统性炎性反应,其分子机制尚不清楚。本研究通过检测健康奶牛(n=15)和SARA奶牛(n=15)外周血免疫生化指标、外周血中性粒细胞(PMN)黏附能力和自噬流的变化,以及体外病理浓度组胺(7μmol/L)对健康奶牛分离培养的PMN黏附和自噬流的影响,探明SARA奶牛高组胺血症对PMN黏附的影响及其分子机制。结果显示,SARA奶牛与健康奶牛相比平均日产奶量下降14.3%;SARA奶牛血清中脂多糖(LPS)的含量从不可检测升高到0.22 EU/mL左右,而组胺浓度从平均1.12μmol/L增加到6.32μmol/L;血清急性期反应蛋白内毒素结合蛋白(LBP)、触珠蛋白(Hp)和血清淀粉样蛋白(SAA)的浓度均有显著性增加,促炎因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素1β(IL-1β)的平均浓度也有明显升高;免疫印迹结果显示,自噬标记分子微管相关蛋白1轻链3-β(LC3-II)和自噬降解底物P62蛋白水平增多,表明自噬流受阻;黏附试验显示SARA奶牛PMN黏附能力增强,且SARA奶牛PMN表面主要黏附分子白细胞功能相关抗原-1(CD11a)表达增加了约0.5倍,而巨噬细胞功能相关抗原-1(CD11b)表达增加了约3倍,表明SARA奶牛PMN自噬流抑制会导致黏附增强;体外结果显示,组胺可以导致自噬流阻断以及PMN黏附能力的增强,说明SARA奶牛PMN黏附增强主要由高组胺血症引起。结果表明,SARA奶牛高组胺血症可以通过抑制自噬流引起中性粒细胞黏附增强,进而导致系统性炎性反应。
2021年05期 v.41;No.293 992-998+1010页 [查看摘要][在线阅读][下载 1493K] [下载次数：202 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]