预防兽医学

  • 鉴别猪流行性腹泻病毒ORF3基因截短株常规PCR及双重荧光PCR方法的建立及初步应用

    杜琛;廖梦娟;曾德平;唐桂浩;闭云贵;柏家果;陆颖;速雪丽;陈樱;韦祖樟;黄伟坚;欧阳康;

    猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪急性肠道传染病。PEDV细胞适应性毒株与其他毒株之间的区别主要发生在ORF3基因,该基因的缺失可作为病毒适应细胞的标志。本实验室前期分离获得了1株广西自然截短的PEDV毒株17GXCZ-1ORF3d,为更好地鉴别不同类型毒株,本研究建立了可鉴别PEDV ORF3基因自然截短株的常规PCR以及双重荧光PCR检测方法。结果显示,2种方法均能鉴别PEDV ORF3基因截短株,且特异性好。另外,双重荧光PCR的检测下限为10~(0.59)PFU/mL,比所建立的常规PCR方法灵敏100倍,敏感性高。对收集的221份临床样品进行初步应用,常规PCR检出126份阳性样品,其中鉴别出14份ORF3基因截短株单独感染样品,而双重荧光PCR检出阳性样品145份,同样鉴别出14份ORF3基因截短株单独感染样品。本研究建立的2种PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,对PEDV ORF3基因截短株的快速鉴别与检测具有重要意义。

    2022年09期 v.42;No.309 1737-1743页 [查看摘要][在线阅读][下载 904K]
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  • 利用E.coli表达PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒的不同策略及免疫原性评价

    赵强;刘莹;赵云环;翟刚;张帅;郭晓旭;范京惠;左玉柱;

    为得出在大肠杆菌(E.coli)中制备PCV2 VLPs的最佳策略,通过PCR方法,从临床样本中扩增出野生型nCap基因,并对其进行密码子优化合成yCap。以pET-32a为表达载体,构建重组质粒pET-32a-nCap和pET-32a-yCap,以BL21和含有稀有密码子tRNA的Rosetta-gamiB感受态细胞作为表达菌株,以相同体系培养并经IPTG诱导表达,称重比较收获的湿菌体量,通过SDS-PAGE与Western blot对Cap蛋白的表达方式及免疫反应性进行鉴定,使用镍亲和层析法进行纯化并通过SDS-PAGE分析纯化效率,并利用透射电镜观察能否形成VLP,将形成VLP的蛋白以弗氏佐剂为佐剂制备疫苗免疫小鼠,使用ELISA试剂盒测定特异性抗体IgG及细胞因子。结果显示,未经密码子优化的Cap蛋白只能在Rosetta-gamiB中表达,命名为VLP-B,经密码子优化的Cap蛋白在BL21和Rosetta-gamiB中均能表达,分别命名为VLP-A及VLP-C,3种蛋白均主要以可溶性形式表达且VLP-A的产量高于VLP-B、VLP-C;经镍亲和层析法纯化后皆可在透射电镜下观察到大量直径在20 nm左右的VLPs,但VLP-C纯化效率极低,VLP-A效果最佳,VLP-B次之;50μg/只重组VLPs免疫小鼠后(dpi)抗体水平迅速升高,14 d时均已达到阳性临界值,并维持在一个较高的水平直至42 d,同时也诱导产生了细胞因子反应,VLP-C免疫原性最佳,VLP-B次之,VLP-A相对较差。由此可知,将Cap基因密码子优化并提供大肠杆菌所缺少的稀有密码子的tRNA的促进VLPs组装效果要优于提供tRNA,更优于密码子优化,但蛋白表达量低,无法使用镍亲和层析得到理想效果,仍需进一步探索纯化方式。此外,仅将Cap基因密码子优化,产量相对较高,可经镍亲和层析法纯化,但免疫原性相对较弱。结果表明,本研究为PCV2 VLPs疫苗的进一步研究和生产提供了参考依据,对于降低疫苗成本和研制相关生物制品具有重大意义。

    2022年09期 v.42;No.309 1744-1751页 [查看摘要][在线阅读][下载 3645K]
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  • PCV2、PCV3和PCV4三重荧光PCR鉴别检测方法的建立及应用

    高艺祥;王金凤;张倩;孙晓霞;刘立兵;顾文源;马宏伟;马增军;韩庆安;王建昌;

    根据猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)和猪圆环病毒4型(porcine circovirus 4,PCV4)保守区域基因序列合成特异性的引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时快速高效鉴别检测PCV2、PCV3和PCV4的三重荧光PCR方法。结果显示,所建立的三重荧光PCR方法仅对PCV2、PCV3和PCV4出现阳性扩增,与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪支原体肺炎(M.hyo)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见病原无交叉反应;对PCV2、PCV3和PCV4的最低检出限分别为1.69×10~1,1.38×10~2,1.42×10~2拷贝;组内和组间试验变异系数均小于1.6%,重复性好。进一步应用所建立的PCV2、PCV3和PCV4三重荧光PCR方法对263份猪临床样品进行检测,结果检出168份PCV2阳性(阳性率为63.88%),35份PCV3阳性(阳性率为13.31%),21份PCV4阳性(阳性率为7.98%),其中PCV2/PCV3/PCV4共感染3份(阳性率为1.14%),检测结果与单重荧光PCR方法一致。本研究所建立的PCV2、PCV3和PCV4三重荧光PCR方法可以有效的实现对PCV2、PCV3和PCV4的同时快速检测。

    2022年09期 v.42;No.309 1752-1757+1763页 [查看摘要][在线阅读][下载 1258K]
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  • 非洲猪瘟病毒抗原检测试纸条检测方法的建立及初步评价

    蒋菲;杨春江;汪葆玥;张昕;张莹;王睿男;赵荣茂;吴佳俊;王传彬;倪建强;

    分别以非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白特异性单克隆抗体3E1株和7A7株作为检测抗体和捕获抗体,建立了ASFV抗原试纸条检测方法。该方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;对ASFV P72重组蛋白的最低检测量为2.50μg/L;稳定性试验结果表明,试纸条可在2~8℃条件下保存15个月。对100份临床样品的检测结果显示,该方法与荧光定量PCR的符合率为85%。本研究建立的ASFV抗原检测试纸条特异性强、灵敏度高,可用于临床样品中ASFV抗原的检测。

    2022年09期 v.42;No.309 1758-1763页 [查看摘要][在线阅读][下载 190K]
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  • 宿主Ncor1基因沉默对VSV复制的影响

    刘飞;王仁铃;孙诗惠;王蓬琨;宋德光;关继羽;陆慧君;

    核受体共抑制因子1(NCOR1)组织分布广泛,可调节基因转录。前期研究表明,与NCOR1功能密切相关的转导蛋白(β)样1X连接受体1(TBL1XR1)在水疱性口炎病毒(VSV)复制进程中发挥促进功能。为明确NCOR1因子在VSV复制增殖过程中的作用及机制,首先设计并构建靶向Ncor1的shRNA过表达质粒shNcor1。将shNcor1质粒与骨架质粒共转染293T细胞,获得表达shNcor1的慢病毒颗粒。用慢病毒感染小鼠巨噬细胞(RAW264.7)并构建Ncor1基因沉默细胞系。VSV分别感染Ncor1沉默与对照细胞系后,通过Q-PCR和TCID_(50)检测VSV的转录、复制水平。结果表明,Ncor1基因沉默能抑制VSV的转录及复制。此外,当Ncor1基因沉默时,经VSV诱导的干扰素相关基因Ifit1及Ifit2的转录水平显著升高,提示NCOR1对病毒复制的调控与干扰素信号的激活相关。本研究从宿主细胞出发为阐明VSV的致病机制提供了新的思路。

    2022年09期 v.42;No.309 1764-1768+1785页 [查看摘要][在线阅读][下载 1798K]
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  • 抗禽流感病毒(H5N1)入胞单分子抗体过表达慢病毒载体的构建及其稳转细胞株的建立

    王瑜;孙赫;岳玉环;吴广谋;张国利;邱月;蔄弘扬;田园;李泽鸿;

    构建过表达抗禽流感病毒(H5N1)M1蛋白入胞单分子抗体(TAT-ScFv-mFc)的慢病毒载体,筛选获得稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T稳转细胞株。PCR扩增目的基因,将其插入质粒pLVX-mCMV-ZsGreen1-Puro中,构建pLVX-TAT-ScFv-mFc-ZsGreen1-Puro慢病毒过表达质粒,对重组质粒进行慢病毒包装后使用转染试剂复合物转染HEK293T细胞系,并使用嘌呤霉素(Puro)筛选阳性表达细胞,经过扩大培养及裂解后,以ProteinG纯化目的蛋白并对蛋白纯品进行鉴定。Western blot检测结果显示,成功获得了稳定表达TAT-ScFv-mFc的HEK293T细胞株。ELISA、SDS-PAGE、BCA结果显示成功获得预期目的蛋白2 mL(0.39 g/L)。结果表明,本研究成功建立了稳定表达抗H5N1病毒抗体的293T细胞系,为进一步研究TAT-ScFv-mFc的功能结构奠定了基础,也同时为真核表达系统的抗体制备研究提供了参考依据。

    2022年09期 v.42;No.309 1769-1774页 [查看摘要][在线阅读][下载 1313K]
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  • 山羊痘病毒P32基因的截短表达及间接ELISA方法的建立和应用

    孟卫芹;王金良;许崇友;陈金龙;沈志强;

    为建立一种山羊痘病毒(GTPV)抗体快速检测方法,通过PCR技术扩增了P32蛋白优势抗原区(2-141AA)基因序列,将其连接至原核表达载体pET-28a(+)上,转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后获得了重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明该蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立了快速检测GTPV抗体的间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性与可重复性,为GTPV的免疫抗体检测及流行病学调查提供了一种血清学诊断方法。

    2022年09期 v.42;No.309 1775-1779页 [查看摘要][在线阅读][下载 257K]
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  • 新疆部分地区马盖塔病血清流行病学调查

    仇相书;陈川威;王琛;侯金利;史宁;朱翔宇;鲁会军;金宁一;

    为了解新疆部分地区马盖塔病的流行情况,采用血清中和试验对采自新疆克拉玛依市、阿克苏地区、昌吉回族自治州和伊犁哈萨克自治州的294份马血清样品进行盖塔病毒(Getah virus, GETV)中和抗体检测。结果显示,马血清样品GETV中和抗体阳性率为77.2%(227/294),阳性血清中和抗体几何平均滴度(GMT)为1∶145.8;不同地区马血清中和抗体阳性率在72.2%~82.1%之间(P=0.448),阳性血清中和抗体GMT在1∶114.3~1∶202.4之间(P=0.123);纯血马中和抗体阳性率和阳性血清中和抗体GMT(83.6%,1∶183.8)显著高于伊犁马(71.9%,1∶121.9)(P=0.018;P=0.012);规模场马中和抗体阳性率(83.0%)极显著高于散养场(56.9%)(P<0.01),阳性血清中和抗体GMT无显著性差异;不同年龄马中和抗体阳性率和阳性血清中和抗体GMT分别在20.0%~80.6%和1∶34.8~1∶153.1范围内,>3岁龄组显著高于<1岁龄组和1~3岁龄组(P<0.05)。结果表明,新疆部分地区马群盖塔病毒感染较为严重,这可能与品种、年龄以及养殖模式密切相关。本次调查数据为新疆地区马盖塔病的防控提供参考。

    2022年09期 v.42;No.309 1780-1785页 [查看摘要][在线阅读][下载 301K]
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  • 边界病病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

    毛立;张纹纹;李文良;杨蕾蕾;孙敏;程子龙;李基棕;郝飞;刘茂军;

    边界病(border disease)由边界病病毒(border disease virus, BDV)引起,导致绵羊和山羊持续感染和繁殖疾病,2012年在国内首次报道,但目前尚无特异的RT-PCR方法对该病原进行检测。本研究通过比对黄病毒科瘟病毒属病毒的全基因组序列,以3′-UTR基因为靶基因,设计了特异扩增BDV的引物。通过构建重组质粒pMD18-T-BDV,以其作为标准品建立了BDV的RT-PCR检测方法。进一步优化该方法的反应条件,并进行特异性、敏感性及临床样品检测。结果显示,该方法在退火温度48~60℃时均可特异扩增BDV,通过检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)和猪瘟病毒(CSFV)提取的RNA,该方法可特异扩增BDV而对其他同属病毒检测均呈阴性,表明其特异性良好;同时,该方法具有良好的敏感性,最低检出限可达10~1拷贝/μL,敏感性极高。利用该方法检测BDV持续感染羊和人工感染羊,发现持续感染羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、卵巢、脑等器官均可检测到BDV,而人工感染羊只能在感染3~7 d的血液和淋巴结中检测到病毒RNA,其他器官中未检测到病毒。本研究建立了特异检测BDV的RT-PCR方法,并证明了BDV在持续感染羊和一过性感染羊中的病毒分布情况,为其可能的排毒途径提供了依据。

    2022年09期 v.42;No.309 1786-1789+1816页 [查看摘要][在线阅读][下载 225K]
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  • 番鸭小鹅瘟病毒感染诱导细胞自噬

    王劭;肖世峰;程晓霞;江丹丹;林锋强;朱小丽;陈少莺;陈仕龙;

    旨在探讨番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)感染番鸭成纤维细胞与鸭胚胎肝间充质干细胞后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬对病毒增殖的作用。借助激光共聚焦方法观察LC3自噬荧光颗粒,以及Western blot检测细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、磷酸化mTOR(p-mTOR)表达量以及转录因子TFEB磷酸化水平,应用自噬调节剂(雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤与氯喹)来研究细胞自噬对病毒增殖的影响,结果显示,MDGPV感染能够促进易感细胞自噬发生,细胞自噬有利于MDGPV在易感细胞中的复制。本研究表明MDGPV感染诱导的细胞自噬对维持病毒在宿主细胞中的复制增殖过程中发挥作用。

    2022年09期 v.42;No.309 1790-1797页 [查看摘要][在线阅读][下载 1223K]
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  • TLR2和NLRP3对大肠杆菌诱导的细胞因子分泌、脏器损伤和小鼠死亡的调控作用

    任佩佩;巩志国;张兰欣;顾柏臣;赵佳敏;高飞菲;刘博;

    大肠杆菌(Escherichia coli)感染宿主时,体内免疫细胞表达的模式识别受体可对其进行识别,进而激活下游炎症信号转导通路,介导细胞因子分泌,从而对炎症反应进行调控。模式识别受体TLR2和NLRP3在大肠杆菌诱导的宿主炎症反应过程中发挥的具体调控作用尚不清楚。本研究分析了致病性大肠杆菌感染小鼠后血清、腹腔灌洗液和腹腔巨噬细胞上清液中促炎性细胞因子(TNF-α和IL-1β)和抗炎因子(IL-10)分泌的情况,以及小鼠组织脏器的损伤水平和存活率。结果显示,大肠杆菌感染小鼠后,TLR2~(-/-)和NLRP3~(-/-)小鼠与C57BL/6J小鼠相比死亡更为迅速。此外,大肠杆菌感染C57BL/6J小鼠的血清和腹腔灌洗液中,TNF-α和IL-10的分泌水平显著低于TLR2~(-/-)和NLRP3~(-/-)小鼠(P<0.001)。该结果与大肠杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞获得的结果可相互对应。免疫荧光检测结果显示,与野生型C57BL/6J小鼠相比,大肠杆菌感染TLR2~(-/-)和NLRP3~(-/-)小鼠后其肝脏和肾脏中组织损伤标志物HABP2蛋白表达处于较高水平(P<0.01)。结果表明,在大肠杆菌感染过程中,TLR2和NLRP3对大肠杆菌诱导的宿主细胞因子分泌具有一定的下调作用,进而可能对宿主脏器损伤发挥一定的调控作用,并对小鼠的死亡率产生影响。

    2022年09期 v.42;No.309 1798-1804页 [查看摘要][在线阅读][下载 2353K]
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  • 干酪乳杆菌抗LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤作用及机制

    李可;杨明;田梦悦;贾丽;梁艳艳;马玉忠;

    为探究干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)炎性损伤的缓解作用及机制,将10~4,10~5,10~6 CFU/mL的干酪乳杆菌与奶牛乳腺上皮细胞共培养3 h后加入1 mg/L的LPS继续培养8 h,使用荧光定量PCR和Western blot方法检测相关炎性因子mRNA和通路关键蛋白的表达量。结果显示,与对照组相比,10~5,10~6 CFU/mL的干酪乳杆菌预处理组显著降低了奶牛乳腺上皮细胞IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表达(P<0.05),同时,10~4,10~5,10~6 CFU/mL的干酪乳杆菌预处理显著降低了IкBα和p65蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。结果表明,干酪乳杆菌可以通过抑制奶牛乳腺上皮细胞NF-κB信号通路及相关炎性因子基因的表达,从而发挥抗炎作用。

    2022年09期 v.42;No.309 1805-1809页 [查看摘要][在线阅读][下载 355K]
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  • 牛呼吸道疾病克雷伯菌毒力及耐药性分析

    侯铭源;林倩颖;梁艳艳;王星;贾丽;杨欣雨;袁丽宁;李连敏;武英豪;马玉忠;

    为分析牛呼吸道疾病克雷伯菌的毒力性及其耐药性,采集患呼吸道疾病牛样品,对克雷伯菌进行分离鉴定,并对其血清型、毒力性、耐药性及其可移动元件的水平传播情况进行检测。结果显示,分离得到10株致病性克雷伯菌。在这些菌株中,检测出3种血清型,K2为优势血清型。分离菌对氨苄西林及阿莫西林的耐药率高达100.0%(10/10),其中8株为多重耐药菌。ureA毒力基因、gyrA与acc(3)-IIa耐药基因的检出率高达100.0%(10/10)。可移动元件中IS26的检出率高达80.0%(8/10)。可移动遗传元件不仅促进了细菌之间耐药基因的传播,还有可能与耐药基因有协同作用,增强细菌的耐药性。这为治疗由克雷伯菌导致的牛呼吸道疾病提供了依据。

    2022年09期 v.42;No.309 1810-1816页 [查看摘要][在线阅读][下载 872K]
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  • 马链球菌马亚种-MDMC0316株的分离鉴定与遗传进化分析

    卡楚拉;白伟琴;李琦;乌仁达来;塔娜;伊拉格其;格日勒图;

    从内蒙古锡林浩特市某马场中疑似患有马腺疫的马匹下颌部淋巴结中采集脓汁样本,通过实验室常规检测和分子生物学方法进行细菌分离鉴定和遗传进化分析。采用绵羊血琼脂平板划线法分离和纯化培养可疑细菌,并进行革兰染色和镜检;绘制分离菌生长曲线,并对该分离菌进行常规生化试验;对16S rRNA基因使用标准PCR方法扩增和测序并应用Mega 7.0生物软件绘制出该分离菌的系统发育进化树并确定其种属地位;对纯化的分离菌进行药物敏感性试验,拟筛选出辅助治疗效果最佳的抗生素类药物。结果显示,分离菌在绵羊血琼脂平板上呈现典型的β溶血环,染色特点为革兰阳性链球菌,从生长曲线上可以看出分离菌16 h后达到平台期;在生化试验中,分离菌对蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖利用呈现阳性,而对乳糖、甘露醇、蕈糖、七叶苷、山梨醇等呈现阴性,对精氨酸脱羧酶分解试验呈阳性,而对硝酸盐(还原)试验、胆汁溶菌试验、马尿酸盐分解试验、VP试验呈现阴性,提示分离菌与典型马链球菌马亚种生化试验标准结果吻合;根据16S rRNA基因BLAST比对分析发现,分离菌与NCBI中已注册的马链球菌马亚种序列同源性为100%,遗传进化树上可以看出分离菌与新疆分离株XJALT-10-M2遗传距离最近,位于相同的分支。为此,将该分离菌命名为马链球菌马亚种MDMC0316株(GenBank登录号:OK254140.1)。最后,根据药物敏感性试验结果,可确定多西环素与红霉素为该分离菌最敏感的抗生素类药物。结果表明,在内蒙古锡林郭勒地区初次分离鉴定了1株马链球菌马亚种,菌株编号为MDMC0316,并进行了遗传进化分析,临床最佳治疗抗生素类药物选定为多西环素与红霉素。

    2022年09期 v.42;No.309 1817-1822页 [查看摘要][在线阅读][下载 1141K]
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  • Beltex羊肺源多杀性巴氏杆菌和溶血曼氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

    王子杰;操义恒;马雪;张丽媛;王燕;周霞;黄新;吴桐忠;张星星;钟发刚;

    为了确定新疆石河子地区某羊场引起呼吸道感染的4月龄病羊的细菌性病原、血清型、毒力基因以及耐药性特点,本研究采用细菌常规分离鉴定及PCR鉴定方法从病变肺脏组织中分离鉴定细菌,并对分离株进行血清型分型、毒力基因检测、药物敏感性及耐药基因检测。结果显示,从肺脏组织中分离到了2株菌,确定为多杀性巴氏杆菌(Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mh),且荚膜血清型分别为D型和A6型。对分离菌株进行了7类25种毒力基因检测,Pm检测到了exbB、exbD、tonB、hgbA、fur、oma87、psl、sodA、sodC、tbpA、fimA、toxA共5类12种毒力基因,Mh检测到了1种毒力基因sodA。2株菌均对青霉素耐药,对大部分药物敏感。对8类21种耐药基因检测表明,2株菌未检测到相关耐药基因。结果为本地区绵羊呼吸道疾病的流行病学调查与临床治疗提供理论依据。

    2022年09期 v.42;No.309 1823-1829+1850页 [查看摘要][在线阅读][下载 264K]
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  • 鸭疫里默氏杆菌Porin蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

    包涛涛;鲜思美;顾庆林;杨倩;梁倩;杨先富;吴通奎;王正文;廖飞;

    旨在建立一种新型可适用于鸭疫里默氏杆菌(RA)病抗体检测的间接ELISA方法。以血清2型RA贵州分离株为研究对象,将其微孔蛋白Proin编码的基因克隆至pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-32a-porin,在E.coli BL21(DE3)中使用IPTG诱导后表达。以纯化后的Porin蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化建立一种检测RA抗体的间接ELISA方法,对其性能进行综合评价。结果显示,该方法具有较好的敏感性、重复性及特异性,阳性血清经1∶6 400稀释后检测结果仍为阳性,批内变异系数(CV)在1.27%~4.90%之间,批间CV在2.59%~5.43%之间,该方法可特异性地检测出抗RA抗体,与禽流感病毒(AIV)H5亚型、AIV H7亚型、新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)及E.coli阳性血清均无交叉反应,与商品化ELISA抗体试剂盒检测相比,两者符合率为97.26%。使用建立的ELISA方法对临床采集的801份样品血清开展抗体检测分析(626份为已免疫鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗“血清1型+血清2型”的样品血清,175份为未免疫任何鸭传染性浆膜炎疫苗的样品血清),有564份为免疫抗体阳性,检出阳性率为90.01%(564/626),有36份为感染抗体阳性,检出阳性率为20.99%(36/175)。结果表明,本研究建立了一种新型可用于RA抗体检测的间接ELISA方法,为RA的血清学流行病学调查提供了新的检测方法。

    2022年09期 v.42;No.309 1830-1837页 [查看摘要][在线阅读][下载 365K]
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  • 蚯蚓源贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及安全性评价

    郭艺伟;刘依山;吕兰;包永占;潘兴亮;王玉田;郑瑞峰;

    为了探究蚯蚓源菌株的安全性,从蚯蚓肠道分离1株菌命名为Y1,对该菌进行生化鉴定分析、16S rRNA测序、蛋白酶测定、溶血试验、药敏试验、抑菌试验和动物安全性试验评价该菌株的安全性。结果显示:该菌为贝莱斯芽孢杆菌,革兰染色呈阳性,能产生蛋白酶,无溶血反应;对环丙沙星、头孢羟氨苄、氟苯尼考、替米考星、庆大霉素、红霉素和复方新诺明高度敏感,对氨苄西林、羟氨苄青霉素及青霉素耐药;对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著抑制效果(P<0.05);试验组小鼠脏器指数与对照组相比无显著性变化(P>0.05);通过Alpha指数与Beta指数多样性分析,在门水平上,试验组拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)丰度升高并占主导地位,在属水平上,试验组小鼠肠道中的特异性菌群Muribaculaceae、阿克曼菌属(Akkermansia)丰度升高;稀释性曲线显示试验组群落多样性较高;P coA分析表明试验组菌种相似性较大;细菌无移位情况出现。结果表明,贝莱斯芽孢杆菌Y1有一定的安全性,可以调节小鼠肠道菌群,提高微生物多样性,改善肠道健康。

    2022年09期 v.42;No.309 1838-1844页 [查看摘要][在线阅读][下载 2253K]
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人兽共患病

  • 鉴别布鲁菌A19疫苗株的双重荧光定量PCR方法的建立与应用

    董浩;原霖;刘洋;徐阳;陈亚娜;沈子莹;梁春南;

    为建立一种可以鉴别布鲁菌A19疫苗株和其他布鲁菌的双重荧光定量PCR方法,分别设计特异性扩增布鲁菌BCSP31基因序列和A19疫苗株缺失序列的2套引物探针,对引物和探针浓度进行优化,并对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果表明,用该方法对2种阳性质粒标准品的最低检测限均为10拷贝/μL;该方法扩增A19疫苗株的核酸时只呈现出1条特异性的扩增曲线,扩增其他布鲁菌菌株(包括疫苗株与野毒株)的核酸时,会出现2条特异性的扩增曲线,而非布鲁菌的细菌核酸均未出现特异性的扩增曲线。该方法的批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对122份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法和Bruce-Ladder PCR方法,并可对A19疫苗株的核酸进行鉴别。本研究建立的鉴别布鲁菌A19疫苗株的双重荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可作为临床上进行A19疫苗株鉴别的一种检测方法。

    2022年09期 v.42;No.309 1845-1850页 [查看摘要][在线阅读][下载 273K]
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  • 青海地区牦牛牛支原体核酸检测分析

    王方国;陈胜利;颜新敏;郝华芳;兰仕梅;李章程;马丽娜;储岳峰;曹随忠;

    为了解青海地区牦牛牛支原体分子流行情况,本试验采用荧光定量PCR(qPCR)方法对2018-2019年采集青海地区的636份牦牛鼻拭子进行牛支原体核酸检测,并对不同地区、年份、年龄、性别、饲养模式的牦牛牛支原体核酸检测结果进行统计分析。结果显示,牛支原体的总检出率为21.86%(139/636),牛支原体在青海不同地区(海北州、海南州、西宁市、海西州)牦牛群存在不同程度的流行(0%~44%);2018年11月检出率为18.02%,2019年6月检出率26.37%;雌性检出率(27.84%)高于雄性检出率(18.41%),差异性显著(P<0.05);0~2岁的检出率最高,为22.26%,其次为3~6岁,检出率为19.50%,6~12岁检出率最低,为18.03%,差异性显著(P<0.05);放牧养殖模式下检出率最高(34.00%),其次是集约化养殖模式(22.81%),放牧+圈养养殖模式下检出率最低(17.47%),差异显著(P<0.05)。青海不同地区牦牛牛支原体存在不同程度的流行,不同年龄、性别、饲养模式存在统计学差异。本研究为明确青海地区牦牛牛支原体流行情况,为制定合理的防制措施提供了参考数据。

    2022年09期 v.42;No.309 1851-1855+1868页 [查看摘要][在线阅读][下载 385K]
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  • 一起D型产气荚膜梭菌引起小规模关中奶山羊腹泻报道

    吴克;冯航;王斌;王晨骁;王娟;杨增岐;

    自陕西省富平县某规模化关中奶山羊养殖场病羊舍11份腹泻奶山羊肛门拭子中分离得到8株产气荚膜梭菌,毒素基因检测显示8株产气荚膜梭菌均为携带cpa、etx和cpb2毒素基因的D型产气荚膜梭菌;结合其耐药性和生物膜形成能力高度一致,判断本试验产气荚膜梭菌分离株属于同1株小范围流行的D型产气荚膜梭菌。该D型产气荚膜梭菌攻毒小鼠后,可引起小鼠明显肠道出血和鼓气,组织病理学观察可见肠绒毛破碎、肠壁肌肉层结构松散,推断此次奶山羊腹泻与该D型产气荚膜梭菌密切相关。75%酒精、新洁尔灭和84消毒液等消毒剂对该D型产气荚膜梭菌效果良好,生产中为预防产气荚膜梭菌的区域性传播致病应加强对环境的清扫和消毒。

    2022年09期 v.42;No.309 1856-1860页 [查看摘要][在线阅读][下载 1174K]
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基础兽医学

  • 黄芩苷对大肠杆菌AcrB外排泵的抑制作用及其机制

    赵子玉;张鹏;王春光;张铁;

    AcrAB-TolC外排泵系统是大肠杆菌产生多重耐药性(MDR)的重要生物学基础,内膜转运蛋白(AcrB)在该系统中起着决定性作用。为解决大肠杆菌的多重耐药问题,本试验以大肠杆菌AcrB为靶点通过虚拟筛选工具Autodock Vina进行筛选,得到与AcrB结合较好的中药单体抑制剂—黄芩苷,通过DS Visualizer分析黄芩苷与AcrB蛋白的相关作用力,应用联合抑菌试验验证黄芩苷与抗生素的联合抑菌作用,采用尼罗红外排试验验证黄芩苷对外排泵转运子AcrB的外排抑制作用,以实时荧光定量PCR方法检测黄芩苷对AcrB表达相关基因的影响,最后通过内膜质子梯度影响试验与外膜渗透稳定性试验验证黄芩苷抑制外排泵转运子AcrB的作用机制。结果显示,中药单体黄芩苷与AcrB蛋白结合位点形成氢键,并与对接位点多个氨基酸残基形成了疏水作用力,两者的结合作用力为44.7 kJ/mol;黄芩苷与磷霉素钠、头孢噻肟钠、氯霉素对大肠杆菌E320具有协同作用(FICI≤0.5);黄芩苷具有明显阻滞尼罗红外排作用的趋势且能够通过显著提高AcrB负调控蛋白AcrR、MarR、MppA、RpoS的mRNA表达从而降低AcrB蛋白的表达;0.625 g/L的黄芩苷对内膜质子梯度浓度与外膜渗透性均无明显影响。结果表明,黄芩苷具有成为多重耐药大肠杆菌外排泵抑制剂的潜质。

    2022年09期 v.42;No.309 1861-1868页 [查看摘要][在线阅读][下载 1112K]
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  • 黄梁木枝叶水提物的抗菌作用及对小鼠免疫和肠道菌群的影响

    李晓琳;陈婷;丁宁;习欠云;张永亮;

    黄粱木(Neolamarckia cadamba(Roxb.)Bosser)具有多种药理作用,但发挥作用的活性成分及作用机理仍有待揭示,本研究旨在评价黄梁木枝叶水提物对小鼠抗炎、抗氧化作用及对肠道菌群的影响。采用热水浸提法获得黄梁木枝叶水提物(aqueous extract of Neolamarckia cadamba branch and leaf, NCAE)并进行体外抑菌活性检测。将24只小鼠随机分为空白组、黄粱木组(3 g水提物/kg)和抗生素组(0.01 g/kg庆大霉素),每组8只,进行动物试验。采用试剂盒法测定小鼠过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、IL-2、IL-6、TNF-α等因子含量,高通量测序法分析小鼠肠道菌群变化。结果显示,NCAE中含有多糖、黄酮、总酚和三萜皂苷等活性物质,且对金黄色葡萄球菌、猪大肠杆菌、猪霍乱沙门菌均显示抑菌活性。活体试验表明,黄粱木组小鼠血清、脾脏和肾脏中IL-6含量显著下降(P<0.05);血清和肾脏中TNF-α含量显著降低(P<0.05);黄粱木组小鼠脾脏和肾脏中CAT含量显著升高(P<0.05);而血清、脾脏和肾脏中MDA含量显著降低(P<0.05);饲喂NCAE后小鼠盲肠中另枝菌属、瘤胃球菌属的含量显著升高(P<0.05),毛螺菌属、拟普雷沃菌属、罗氏菌属和厌氧棍状菌属的含量显著降低(P<0.05)。结果表明,NCAE具有体外抑菌活性,在体内有提高机体抗炎和抗氧化能力,增加盲肠微生物菌群丰富度、调节菌群种类和数量,具有替代抗生素的潜力。

    2022年09期 v.42;No.309 1869-1877页 [查看摘要][在线阅读][下载 565K]
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  • VDAC1参与调控BCG感染RAW264.7细胞凋亡

    宋阿北;李瑞乾;缪西鹏;谢玉杰;高瑞;许立华;

    旨在研究电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel1,VDAC1)对卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的调控作用及其机制。设计并合成VDAC1的小干扰RNA(si-VDAC1)转染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,再用BCG感染。后续采用MTT法检测RAW264.7细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、线粒体膜电位及细胞内ROS水平,进而通过实时荧光定量PCR和Western blot检测凋亡相关因子Cyt C、Caspase-3、PARP1、Caspase-9基因(mRNA)及其蛋白的表达。随后,通过使用VDAC1寡聚抑制剂VBIT-4对RAW264.7进行孵育2 h后感染BCG,并采用免疫荧光染色技术观察Caspase-3和Western blot检测凋亡相关因子Cyt C、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP1、Cleaved-Caspase 9的含量变化。BCG感染巨噬细胞12 h后,与对照相比,BCG感染后小鼠巨噬细胞存活率约下降至50%,而凋亡率显著上调到52.12%(P<0.001),线粒体膜电位降低(P<0.001),细胞内ROS水平升高(P<0.001),并且凋亡关键调控因子Cyt C、Caspase-3、PARP1、Caspase-9的mRNA及蛋白表达水平显著上调(P<0.001);当用si-VDAC1和BCG共同处理小鼠巨噬细胞时,细胞存活率、细胞凋亡率、线粒体膜电位水平、细胞内ROS水平及凋亡关键调控因子均显著得到了恢复(P<0.001);使用VDAC1寡聚抑制剂VBIT-4处理后同BCG处理组相比,VBIT-4显著抑制了VDAC1寡聚体的形成和凋亡相关因子Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP1、Cleaved-Caspase 9剪切体的含量(P<0.001)。结果表明,VDAC1可通过寡聚形成大的通道影响线粒体外膜通透性,通过Cyt C等凋亡蛋白释放的途径参与调控BCG感染RAW264.7诱导的细胞凋亡。

    2022年09期 v.42;No.309 1878-1888页 [查看摘要][在线阅读][下载 4997K]
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临床兽医学

  • 冠突散囊菌茶对高糖、高脂大鼠的血糖和血脂相关因素的影响

    李兆龙;陈常颂;孔祥瑞;李世荣;

    探讨冠突散囊菌茶粉对高糖高脂大鼠的血糖和血脂相关因素的影响。以健康雄性SD大鼠为试验对象,建立高糖、高脂的大鼠模型,给予不同剂量冠突散囊菌茶粉灌胃干预,研究冠突散囊菌茶粉对大鼠的生长、血糖和血脂指标以及肠道的葡萄糖转运体2(glucose transporter, GLUT-2)和胰高血糖素原基因(proglucagon gene, PLG)的影响。结果显示,冠突散囊菌茶粉能显著降低大鼠体质量、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和空腹血糖含量,进一步研究表明,其能显著改善肝细胞的脂肪化,提高血清高密度脂蛋白(HDL-C)含量,降低各肠段GLUT-2的mRNA水平,明显增加各肠段PLG的mRNA水平。结果表明,冠突散囊菌茶粉降糖和降脂效果明显,其效果与浓度呈相关。

    2022年09期 v.42;No.309 1889-1894页 [查看摘要][在线阅读][下载 2754K]
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  • 番茄红素、菟丝子和泰山磐石散缓解玉米赤霉烯酮对孕鼠生殖毒性的作用

    康俊港;李杨;姜国均;王亚博;马占飞;

    试验旨在探究玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)对妊娠小鼠的毒性损伤及3种中药的缓解作用。将60只8周龄昆明孕鼠随机分为5组,每组12只(设3个重复,每个重复4只)。A组为空白对照组,孕鼠妊娠1~10 d上、下午各灌胃蒸馏水0.2 mL;B组为ZEA组,孕鼠妊娠1~10 d上午灌胃5 mg/kg ZEA,下午灌胃蒸馏水0.2 mL;C、D、E组分别为番茄红素+ZEA组、菟丝子黄酮+ZEA组、泰山磐石散+ZEA组,1~10 d上午灌胃5 mg/kg ZEA,下午分别灌胃20 mg/kg番茄红素、10 mg/kg菟丝子黄酮、1 g/mL泰山磐石散,每次灌胃量均为0.2 mL。母鼠妊娠第11天剖杀,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清雌二醇(E_2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和孕酮(P)水平;取孕鼠子宫,显微镜观察ZEA对子宫形态结构的影响;ELISA检测子宫组织匀浆E_2、FSH、LH和P的含量;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定子宫组织匀浆细胞凋亡相关因子mRNA表达量。结果显示,ZEA导致子宫组织结构损伤、水肿;血清和子宫E_2、FSH和P水平极显著升高(P<0.01),LH水平极显著降低(P<0.01);子宫Bax、Caspase-3和Caspase-8 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01);3种中药均可缓解ZEA引起上述的变化和损伤。结果表明,ZEA对孕鼠产生严重生殖毒性,番茄红素、菟丝子黄酮、泰山磐石散等中药具有缓解其毒性的作用,其中泰山磐石散效果最好。

    2022年09期 v.42;No.309 1895-1901+1908页 [查看摘要][在线阅读][下载 2059K]
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动物科学

  • 尿酸对猪精液液态保存效果的影响

    林敬轶;刘雪;金小虎;石学颖;张天羽;李丹彤;岳顺利;周佳勃;

    旨在探究尿酸对液态保存猪精子质量的影响。通过精子分析仪检测精子活力,低渗肿胀法检测精子的质膜完整性、比色法和硫代巴比妥酸法分别检测总抗氧化能力和丙二醛含量,荧光探针染色检测顶体完整性、活性氧含量和线粒体膜电位,体外受精检测精子受精能力和胚胎发育能力。结果显示,在保存液中添加一定质量浓度的尿酸有助于提高猪精子质量,同时发现尿酸主要是通过提高精子的抗氧化能力和线粒体膜电位来维持精子质量。此外,本研究发现尿酸还能够提高精子受精能力和胚胎发育能力。结果表明,添加5.0 mg/L尿酸对17℃液态保存的猪精液有利,可为新型猪精液保存液的研发提供依据。

    2022年09期 v.42;No.309 1902-1908页 [查看摘要][在线阅读][下载 194K]
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  • 沼泽型水牛FST基因克隆分析与组织表达模式

    汪浩鑫;陈维丽;张俊;许建春;自永宏;杨小芬;石德顺;陆凤花;

    旨在克隆水牛卵泡抑素(follistatin, FST)基因,并对该基因进行生物信息学分析,检测其在水牛不同组织中的表达情况,为进一步探讨FST在水牛胚胎发育过程中的功能奠定基础。从水牛卵巢组织中提取RNA,反转录成cDNA后,利用RT-PCR技术克隆获得水牛FST基因CDS区的全长序列,并进行生物信息学分析。结果显示,水牛FST基因编码区全长1 035 bp,编码344个氨基酸。水牛FST基因与黄牛、鸡、绵羊、人、黑猩猩、褐家鼠、野猪和山羊的同源性分别为99.1%,81.4%,98.4%,91.9%,91.4%,89.3%,93.4%和81.4%,且在不同物种间高度保守,符合生物的进化规律。FST蛋白包含40个α-螺旋、63个延伸链及241个无规则卷曲,分别占11.6%(40个),18.3%(63个)和70.0%(241个),为经典分泌蛋白。qRT-PCR结果显示,FST在水牛胃、肌肉、卵巢、睾丸、心脏、肝脏、肺脏和脾脏组织中均有表达,其中在肺脏和卵巢中表达最高,睾丸中表达最低。本研究克隆得到了沼泽型水牛FST基因,并对不同组织内FST进行了基础的生物信息学分析,为阐明FST在水牛胚胎发育过程中的功能,提高水牛胚胎发育水平提供理论基础。

    2022年09期 v.42;No.309 1909-1914页 [查看摘要][在线阅读][下载 1578K]
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  • 孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡和容受性的影响

    李琦;秦雪;冯瑞;赵骞;郑鹏;

    为研究孕酮对奶牛早期胚胎附植的影响,本试验使用不同质量浓度孕酮处理奶牛子宫内膜上皮细胞,CCK8检测细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因(p53、Cyto-c、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3)和容受性相关基因(TLR-4、NF-κB、IL-6、VEGF、LIF和EGF)的mRNA和蛋白表达变化。结果显示:10,25,50,100μg/L孕酮对细胞活力未见影响;10,100μg/L孕酮对细胞凋亡未见影响,对细胞p53、Cyto-c、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的mRNA及蛋白的表达未见影响,但显著下调了TLR-4 mRNA和蛋白表达水平,显著上调了LIF和VEGF mRNA和蛋白表达水平。结果表明孕酮不影响奶牛子宫内膜上皮细胞的凋亡,但能提高子宫容受性,降低免疫反应。

    2022年09期 v.42;No.309 1915-1922页 [查看摘要][在线阅读][下载 656K]
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  • 2020年全球高致病性禽流感疫情概况及分析

    赵明;康倩;于小静;赵永刚;杨扬仲夫;兰邹然;

    2020年,全球共发生1 366起高致病性禽流感(HPAI)疫情,与2019年相比,疫情发生呈上升趋势。其中,H5N8为优势流行亚型,占总疫情的82.65%,H7亚型疫情点状散发。这一结果提示,H5N8亚型HPAI疫情在全球家禽和野禽中大范围流行,并有可能发展为全球大流行、威胁公共卫生安全。建议应密切关注野鸟迁徙通道等重点区域野禽健康情况,做好疫病监测,提前对新发禽流感疫情进行流行趋势研判,及时做到预警防控。

    2022年09期 v.42;No.309 1923-1926页 [查看摘要][在线阅读][下载 182K]
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