研究论文_预防兽医学

  • 非洲猪瘟病毒CD2v胞外区蛋白多克隆抗体的制备及其应用

    姜文廷;王嘉宾;石雪建;万博;杜永坤;蒋大伟;姬鹏超;张改平;

    非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CD2v蛋白是病毒粒子外层囊膜上的糖蛋白,是介导病毒血细胞吸附和鉴定病毒血清型的关键蛋白,对于ASFV疫苗研发和疫病净化具有重要作用。为制备ASFV CD2v胞外区蛋白多克隆抗体,本研究以NCBI公布的China/2018/AnhuiXCGQ毒株的EP402R基因为研究对象,利用生物信息学软件进行分析,确定蛋白胞外区序列并进行同源性比对,将其进行密码子优化后克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建CD2v胞外区蛋白重组表达质粒His-CD2v-ex-pcDNA3.1(+),转染293 F细胞进行表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,重组蛋白在293 F细胞中以分泌形式表达,相对分子质量为63~89 kDa,能够与ASFV阳性血清特异性结合。利用Ni-NTA进行亲和层析纯化,将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定其生物活性,结果显示兔抗ASFV CD2v胞外区蛋白多克隆抗体能够特异性识别PK-15细胞表达的CD2v蛋白,可用于ASFV CD2v蛋白的Western blot、IPMA和IFA检测。本研究为进一步研究ASFV CD2v蛋白的功能和ASFV诊断方法的建立提供了材料。

    2022年11期 v.42;No.311 2125-2132页 [查看摘要][在线阅读][下载 5207K]
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  • 云芝葡聚糖对非洲猪瘟病毒的体外抑制作用

    刘欣媛;孙元;李素;李连峰;仇华吉;

    研究云芝葡聚糖抑制非洲猪瘟病毒(ASFV)感染效果并初步探索其作用机制。利用CCK-8试剂检测云芝葡聚糖对原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)的毒性并计算半数细胞毒性浓度(CC_(50));ASFV感染细胞,检测不同质量浓度云芝葡聚糖抗ASFV感染的剂量依赖效应,并计算半数抑制浓度(IC_(50));将25 mg/L的云芝葡聚糖与病毒悬液孵育处理,稀释后加入PAM,评价云芝葡聚糖体外直接杀灭ASFV的效果;同时在ASFV复制周期的不同时间点利用云芝葡聚糖处理细胞,确定其抗ASFV效果最显著的效应阶段;通过qPCR检测抗病毒相关细胞因子转录水平来初探其抗病毒机制。云芝葡聚糖的毒性较弱(CC_(50)为270.100 0 mg/L),具有一定的抗病毒效果(IC_(50)为0.957 5 mg/L),其不能直接杀灭病毒;在ASFV感染前6~12 h使用云芝葡聚糖处理细胞,其抑制病毒复制的效果最为显著,且PAM的IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α等细胞因子的mRNA水平显著升高。

    2022年11期 v.42;No.311 2133-2138+2144页 [查看摘要][在线阅读][下载 1841K]
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  • 非洲猪瘟病毒p54蛋白的截短表达及其单克隆抗体的制备

    郑南南;东梦珂;吴宏举;侯浩宇;陈寅龙;李潮;赵慧君;张改平;杜永坤;

    非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞BL21(DE3)中进行诱导表达,获得可溶性表达的重组p54蛋白,通过Ni柱得到良好纯化。之后免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法筛选和3次亚克隆共制备出2株能稳定分泌针对ASFV p54蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100 000~1∶1 000 000之间。Western blot检测表明单克隆抗体与p54蛋白能够特异性反应。经鉴定2株单克隆抗体亚型均为IgG2b,κ。该研究获得的单克隆抗体将为p54蛋白的生物学功能的研究和ASFV血清学检测奠定基础。

    2022年11期 v.42;No.311 2139-2144页 [查看摘要][在线阅读][下载 783K]
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  • 广东地区1株猪非典型瘟病毒的鉴定及遗传演化分析

    侯展鹏;陈文俊;林佩仪;梁宇;刘文俊;曹楠;许丹宁;田允波;黄运茂;付新亮;

    猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus, APPV)是引起仔猪先天性震颤(congenital tremor, CT)的主要病原,给养猪业带来严重的经济损失。为了解APPV在广东地区猪群的流行和变异情况,本研究于2018—2019年从广东地区采集12份疑似CT的病料样品,通过RT-PCR对APPV进行检测,并对APPV阳性的病料样品通过PCR扩增其全长基因组序列并测序,同时对其ORF和E2基因的同源性、遗传进化关系及E2蛋白氨基酸分子特征进行分析。结果显示,有3份样品为APPV阳性,进一步对其中1份阳性样品通过全基因组PCR扩增得到1条长度为10 989 bp的APPV全长序列,命名为APPV-China/GD-ZK/2018(GD-ZK)。GD-ZK与参考毒株ORF和E2基因的核苷酸同源性分别为80.7%~99.7%,80.8%~99.9%,其中与APPV/CNYJ/2018的同源性最高。分别对GD-ZK株的ORF和E2基因进行遗传演化分析,结果显示,根据遗传进化关系可将APPV划分为Genotype 1、Genotype 2和Genotype 3三种基因型,而本研究中鉴定到的GD-ZK株属于Genotype 2,与APPV/CNYJ/2018的进化关系最近。分子特征分析结果显示GD-ZK株E2蛋白发生了S~(54)T和S~(130)T 2个特征性的氨基酸位点突变,且该突变均存在于Genotype 2。因此这2个氨基酸位点突变可作为APPV基因分型潜在的分子标记。本研究初步揭示了APPV在广东地区猪群中的遗传变异情况,为掌握APPV在广东地区的流行本底奠定了基础。

    2022年11期 v.42;No.311 2145-2151+2157页 [查看摘要][在线阅读][下载 5833K]
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  • 猪圆环病毒3型PCR-ELISA检测方法的研究与应用

    李鹏;孙延举;雷梦瑶;孙国鹏;银梅;苏为为;王选年;刘兴友;王利平;

    为建立一种检测猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的PCR-ELSIA方法,根据GenBank上报道的PCV3全基因组序列,针对其高度保守区域设计1对特异性引物,上、下游引物的5′端分别标记生物素和地高辛。经PCR扩增获得大量带有标记的目的基因,依靠生物素-链霉亲和素的非共价结合作用固定目的基因于载体上,再通过羊抗DIG-HRP的显色反应,建立PCR-ELISA检测方法。结果表明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型无交叉反应,特异性良好。PCR-ELISA方法最低检测限为5.58×10~2 copies/μL,敏感性比常规PCR高100倍(常规PCR的检测限为5.58×10~4 copies/μL)。PCR-ELISA方法批内和批间重复性检测的变异系数分别为1.90%~5.20%和3.89%~9.03%。对132份临床样品进行PCV3检测,PCR-ELSIA检出率为9.10%(12/132),高于常规PCR的检出率(4.55%,6/132)。综上,该方法具有特异、灵敏、安全高效的优点,可为PCV3的诊断、防控和流行病学调查提供新的技术手段。

    2022年11期 v.42;No.311 2152-2157页 [查看摘要][在线阅读][下载 725K]
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  • 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒4型双重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

    张远航;董新莹;张玉勤;刘晓晨;李洪炫;陈曦艋;潘佳佳;陈红英;

    分别靶向PRRSV ORF7基因和PCV4 ORF2基因的高度保守区,设计了2对特异性引物,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR GreenⅠ-based双重实时荧光定量PCR方法。PRRSV和PCV4在同一样品中的区别在于它们独特的熔解温度(Tm),PRRSV为84.5℃,PCV4为79.0℃,而对其他非靶向的猪常见病毒没有显示特定的熔解峰,且检测极限分别为PRRSV的81.5 copies/μL和PCV4的41.1 copies/μL。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR和常规PCR方法对30例有呼吸和繁殖衰竭症状的猪临床样本进行检测,检测结果显示,PRRSV阳性率为20.0%(6/30),PCV4阳性率53.3%(16/30),且PRRSV阳性样品中PCV4检出率为50.0%(3/6),较常规PCR检测更灵敏。该方法可能是检测PRRSV和PCV4共感染的一种快速、灵敏和可靠的方法。

    2022年11期 v.42;No.311 2158-2163页 [查看摘要][在线阅读][下载 1306K]
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  • 1株多谱系毒株重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定和遗传变异分析

    王新东;张康;庞燕丽;黄稳妃;莫清荣;黄静;陈樱;欧阳康;黄伟坚;韦祖樟;

    从发病猪肺脏组织中检出猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV),将毒株命名为GXGG202007。对该毒株进行了病毒的分离以及全基因组测序、遗传演化分析和重组分析。结果显示GXGG202007毒株全基因组为15 517个核苷酸(nt);基于ORF5、nsp2和全基因组构建的系统发育树均显示该毒株处于谱系3分支;同源性分析表明其与QYYZ毒株的相似性最高(91.4%),与欧洲株Lelystad-virus(LV)相似性最低(60.3%);通过多种生物信息学软件的重组分析显示,该毒株存在4个重组事件,是1株以谱系3代表毒株QYYZ为骨架,谱系8毒株和谱系5毒株提供重组片段的多谱系重组毒株,其中与HP-PRRSV-like毒株和RespPRRS MLV-like毒株可能分别在42~2 008,6 884~8 549,13 061~13 853,8 550~9 523 nt处发生了重组,重组断点位于基因组的nsp2、nsp9和ORF3中。

    2022年11期 v.42;No.311 2164-2170+2180页 [查看摘要][在线阅读][下载 6200K]
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  • 猪轮状病毒VP4、VP6蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

    王奕斐;洪大林;米雪;杜琛;边金妮;陈樱;韦祖樟;黄伟坚;欧阳康;

    猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)属于呼肠孤病毒科,轮状病毒属,是引起幼年仔猪发生腹泻的主要病原之一,常与其他病原发生混合感染。PoRV结构蛋白VP4、VP6分别组成病毒的纤突及内衣壳,在病毒侵入、复制以及维持病毒粒子形态中起到重要作用。为研究PoRV VP4和VP6蛋白相关特性,分别扩增VP4开放阅读框中抗原性较好的两部分:58~1 080 bp基因片段(1 023 bp)、1 657~2 328 bp基因片段(672 bp),以及VP6完整开放阅读框(1 191 bp),成功构建重组表达质粒pET32a-VP4-672、pET32a-VP4-1023和pET32a-VP6,经测序正确后转化BL21感受态细胞中,经IPTG诱导,重组蛋白均以包涵体形式表达,融合蛋白大小分别约为44,58,64 kDa,与预期大小相符。将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔源多克隆抗体,间接ELISA方法测定多抗效价均在1∶10~6以上,免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光(IFA)检测结果显示多抗均可与病毒蛋白产生良好的抗原抗体反应。本研究结果可为广西地区PoRV抗原抗体检测方法的建立以及疫苗效果评估提供参考,也为病毒结构蛋白功能研究奠定基础。

    2022年11期 v.42;No.311 2171-2180页 [查看摘要][在线阅读][下载 6111K]
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  • 中国福建地区H5Nx水禽流感病毒Clade 2.3.4.4分支分子特性分析

    朱春华;陈翠腾;陈珍;施少华;刘斌琼;傅光华;黄瑜;

    为了明确中国福建地区HA基因序列遗传进化关系及氨基酸变异特征,本研究对福建省近5年分离的8株H5N8和H5N6亚型病毒进行HA基因序列测定及遗传进化分析,并通过同源序列比对、同源建模、空间三维结构比对方法对HA蛋白抗原进化、受体结合特性、氨基酸关键位点进行分析。研究结果表明,分离得到的毒株HA基因属于Clade 2.3.4.4分支,HA氨基酸序列裂解位点含有多个连续碱性氨基酸,具备高致病性禽流感特征。HA受体结合位点分析表明,福建省分离的这8株病毒受体结合位点相对保守,仅第193和227位点有变异,具有典型的禽源受体结合特性。本研究丰富了我国福建省禽流感病毒的分子流行病学信息,为福建省禽流感的预警及科学防控提供了依据。

    2022年11期 v.42;No.311 2181-2189页 [查看摘要][在线阅读][下载 3806K]
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  • 鹅4种常见病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

    姚鑫炎;孙静;刘宏;吕志航;车艺俊;黄淑坚;袁生;张雪莲;

    为了建立一种能快速检测鹅星状病毒(GoAstV)、鹅圆环病毒(GoCV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank数据库已公布的GoAstV的ORF2基因、GoCV的Rep基因、GPV的VP3基因及DTMUV的NS5基因序列,分别设计4对特异性扩增引物,通过对扩增条件的优化及特异性、灵敏性的检验,建立了可同时检测以上4种病原的多重PCR检测方法,并对40份临床样品进行检测。结果显示,建立的多重PCR检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏性,可同时扩增出大小为731 bp(GoAstV)、543 bp(GoCV)、392 bp(GPV)、200 bp(DTMUV)的特异性片段,且利用本试验建立的多重PCR检测方法对水禽其他病原体进行扩增均呈阴性。该方法对GoAstV、GoCV、GPV及DTMUV最低检出限度分别为4×10~3,4.22×10~3,4.43×10~3,4.73×10~3 copies/μL。单一PCR检测方法对临床病料样品检测结果与多重PCR检测结果一致,证明该方法可用于这4种病原临床病料样品的检测。

    2022年11期 v.42;No.311 2190-2194+2210页 [查看摘要][在线阅读][下载 766K]
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  • 1株新型鸭呼肠孤病毒(SL株)的全基因组测定分析及其致病性

    杨晓伟;陆婧;王凯民;庄鸿琨;田宇森;李俊锋;朱盈名;刘霞;张立武;赵光伟;

    为明确我国川渝地区鸭疑似呼肠孤病毒病的致病原,本试验对患病鸭进行病毒的分离、鉴定、全基因组测序分析及致病性试验。首先针对临床肝脾肿大、出血坏死为主要特征的病例,利用鸭胚传代法进行病毒的分离,结合RT-PCR方法鉴定分离毒株;其次利用二代测序技术对分离毒株进行全基因组测序,利用MEGA X软件对序列进行比对和分析;最后将分离毒接种7日龄健康雏鸭,观察其病死率及肝脏、脾脏组织的病理变化。结果发现F6代病毒能够稳定适应鸭胚,RT-PCR鉴定为呼肠孤病毒,对鸭胚的半数致死量(ELD_(50))为10~(-5.32)/0.2 mL,分离毒命名为SL株。全基因测序显示该毒株全长23 580 bp, GC含量49.62%,共分10个节段,分别为L1~L3、M1~M3和S1~S4(GenBank登录号:MW196679~MW196688)。序列分析显示SL株与新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus, NDRV)具有较高的相似性,为87.02%~99.48%;与番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的相似性次之,为80.09%~98.77%;而与鸡源呼肠孤病毒(ARV)相似度最低,为70.04%~91.15%。系统进化树显示SL株10个基因片段均与NDRV位于同一分支,与GX-Y7和XT18 2个NDRV毒株具有较近的亲缘关系,说明SL株为一新型呼肠孤病毒。同时发现SL毒株中M1片段和L1片段与MDRV也具有较高的进化地位,推测SL株或许存在MDRV和NDRV基因重组现象。致病性试验显示SL株能导致雏鸭死亡,肝脏、脾脏出血肿胀,与临床表现一致。病理组织学观察发现肝细胞以出血、肿胀和空泡变性为主而脾脏以白髓萎缩、淋巴细胞坏死和出现血栓等为特征病变。本试验结果为鸭呼肠孤病毒病的防控及其特异性生物制品的研发提供技术参考。

    2022年11期 v.42;No.311 2195-2201页 [查看摘要][在线阅读][下载 5629K]
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研究论文_人兽共患病

  • 粪肠球菌脑膜炎小鼠脑组织差异表达miRNAs筛查与鉴定

    陈明杰;李益涛;曹梦园;王晨豫;闫雪琪;陈杰;齐亚银;

    旨在通过粪肠球菌感染小鼠构建体内血脑屏障损伤模型,从miRNA角度探究小鼠血脑屏障通透性的分子调控机制。试验采用粪肠球菌XJ1感染小鼠构建血脑屏障损伤模型,并通过检测血脑屏障的通透性、脑组织病理切片观察,血清中PCT和CRP的变化判断模型构建结果。将感染组和对照组脑组织样品进行转录组测序,构建miRNA文库,筛选差异表达miRNA,进行qPCR验证。试验成功构建粪肠球菌感染小鼠体内血脑屏障损伤模型,共鉴定22对差异表达的miRNAs,其中上调表达的miRNAs有8个,下调表达的miRNAs有14个。GO分析结果,包括了20个细胞成分、20个生物学过程和20个分子功能。KEGG富集分析表明,差异表达miRNA的靶基因显著富集于调节干细胞多能性的信号通路、RAS信号通路、MAPK信号通路、神经胶质瘤、FcεRI信号通路等。实时荧光定量PCR结果表明,差异miRNA表达趋势与测序结果一致。得出差异表达的mmu-miR-34b-5p和mmu-miR-21a-5p是关于血脑屏障通透性改变的候选miRNA,为探究miRNA对血脑屏障的调节提供了理论参考。

    2022年11期 v.42;No.311 2202-2210页 [查看摘要][在线阅读][下载 3924K]
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研究论文_基础兽医学

  • 猪NLRP3单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

    刘博;霍芳;徐晴晴;刘海隆;张莹;蔡青云;谷英华;张艳;王文秀;

    为制备猪炎症小体NLRP3的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies, MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NLRP3作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选获得了3株能稳定分泌NLRP3蛋白的杂交瘤细胞株9H5、13E1、15E2,鉴定了抗体亚类,将目的蛋白逐步截短后鉴定出了单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,MAb 9H5和15E2识别的抗原表位序列在1~57 aa之间,MAb 13E1识别的表位序列在115~186 aa之间。免疫荧光、Western blot和亚类鉴定试验显示,杂交瘤细胞产生的抗体均可与NLRP3及重组蛋白特异性结合,9H5、13E1、15E2的重链亚型均为IgG 2b,轻链分别为λ、λ和κ链。本研究成功制备了猪NLRP3的单克隆抗体,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的功能提供工具。

    2022年11期 v.42;No.311 2211-2215+2241页 [查看摘要][在线阅读][下载 1460K]
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  • 褪黑素对LPS诱导的犊牛睾丸支持细胞氧化应激和凋亡的影响

    冯瑞;王子铭;黄富硕;李玉龙;张贵学;

    为了探究犊牛睾丸支持细胞(SCs)在血睾屏障形成过程中受到细菌感染的影响以及褪黑素的缓解作用。本试验使用CCK-8试剂盒测定SCs活力,活性氧(ROS)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒分别测量ROS、GSH的表达和SOD活性,Western blot和RT-PCR分析Nfr2、HO-1、p53、Caspase3和Connexin43表达量。结果表明,5 mg/L LPS可以激活Nfr2/HO-1信号通路和p53信号转导,从而显著上调ROS和Caspase3的表达量,显著下调SOD和GSH的活性和表达,造成SCs氧化应激和细胞凋亡,进而下调Connexin43蛋白的表达,降低细胞活力。加入50μmol/L褪黑素后,可以显著抑制激活Nfr2/HO-1信号通路和p53信号转导,从而显著下调ROS和Caspase3的表达量,显著上调SOD和GSH的活性和表达,缓解LPS造成SCs氧化应激和细胞凋亡,进而恢复Connexin43蛋白的表达和细胞活力。结果说明,褪黑素可以缓解LPS诱导SCs的氧化应激和细胞凋亡,对Connexin43蛋白表达有保护作用。

    2022年11期 v.42;No.311 2216-2222页 [查看摘要][在线阅读][下载 3081K]
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  • 灰黄霉素固体分散体在比格犬上的药物代谢动力学分析

    王灵灵;王令令;张雨晴;马宁;何欣;

    为了提高灰黄霉素的溶解度,本研究选用醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(hydroxypropyl methyl cellulose succinate acetate, HPMCAS)的3种规格HF、MF、LF为载体,利用基于溶剂-反溶剂原理的新型共沉淀法制备灰黄霉素固体分散体(amorphous solid dispersion, ASD)。通过粉末X射线衍射、差示量热扫描、傅利叶红外扫描及扫描电子显微镜等对其进行表征,并通过体外溶出度测定和药物代谢动力学对其体内外释药进行研究。结果显示当灰黄霉素与3种载体的比例为1∶9时,均可形成灰黄霉素无定形固体分散体,且以HPMCAS-HF为载体时体外溶出效果最佳,使灰黄霉素的溶解度提高了8倍。另外,在比格犬的药动学研究显示,该固体分散体在体内最大血药浓度(C_(max))比灰黄霉素原料药提高了6.2倍。该固体分散体在4个月内稳定性良好。结果表明,利用新型共沉淀法制备的灰黄霉素固体分散体稳定性良好,能显著提高灰黄霉素的溶解度和生物利用度。

    2022年11期 v.42;No.311 2223-2230页 [查看摘要][在线阅读][下载 5453K]
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  • 慢性冷暴露对小鼠结肠紧密连接的影响

    张思淼;薛琳琳;周文凯;胡惠洁;徐彬;郭景茹;

    为研究慢性冷暴露条件下小鼠结肠紧密连接的变化,试验将小鼠随机分为对照组和冷暴露组,对照组始终置于25℃环境中,冷暴露组置于4℃环境中每天暴露3 h,持续刺激3周,其余时间置于25℃环境中。冷暴露周期结束后将小鼠麻醉处死。利用HE染色观察小鼠结肠的形态学变化,免疫荧光染色观察ZO-1的表达,蛋白免疫印迹技术检测紧密连接相关蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1和炎症因子TNF-α、IL-1β、iNOS的表达。结果显示,与对照组相比,冷暴露组小鼠结肠皱襞消失,紧密连接蛋白的表达量显著降低,炎症因子表达量上调。上述结果表明,慢性冷暴露会导致小鼠结肠紧密连接受损,同时促进炎症反应的发生。

    2022年11期 v.42;No.311 2231-2236页 [查看摘要][在线阅读][下载 3609K]
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  • 内质网应激诱导的自噬在冷暴露诱发小鼠肾脏损伤中的作用

    韩琦;杨焕民;李士泽;张旭;逯静静;徐彬;

    为了研究慢性冷暴露对小鼠肾脏的危害,将试验小鼠随机设置为对照组和冷暴露组,室温对照组小鼠在(24±2)℃的环境中饲养,冷暴露组小鼠在早上8点至晚上8点期间随机于4℃的环境中刺激3 h,共刺激3周,用全自动化分析仪检测小鼠肾功能相关血液生化指标。结果表明冷暴露会影响肾脏的功能。进一步应用q-PCR和蛋白质免疫印迹技术,测定小鼠肾脏炎症相关因子mRNA的表达、内质网应激(ERS)和自噬相关蛋白质的表达水平。研究结果显示与对照组比较,冷暴露组的小鼠肾脏炎症因子mRNA的表达、ERS和自噬相关蛋白质表达都显著升高。结果表明,冷暴露会促进小鼠肾脏产生炎症,引发ERS,诱发自噬。

    2022年11期 v.42;No.311 2237-2241页 [查看摘要][在线阅读][下载 2353K]
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  • 双峰驼β-NGF基因的克隆及在生殖轴系的表达

    王杰;王琪;张勇;南京宏;成力童;赵兴绪;

    选取健康的雌性双峰驼(5~6岁)的下丘脑、垂体、卵巢、子宫角和输卵管等组织,通过RT-PCR扩增CDS全序列,并进行生物信息学分析;通过qRT-PCR,免疫组织化学染色技术(immunohistochemistry, IHC)和蛋白免疫印记(Western blot)技术检测β-神经生长因子(β-nerve growth factor,β-NGF)在各组织的表达。结果显示,双峰驼β-NGF基因的CDS区(783 bp)可编码261个氨基酸残基,分子式为C_(1219)H_(1914)N_(402)O_(365)S_(11),编码的原子个数为3 911,相对分子质量为28.393 74 kDa,理论等电点为9.57,β-NGF编码的为非跨膜可溶性蛋白,其二级结构由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲构成,该蛋白有22个丝氨酸磷酸化位点,11个苏氨酸磷酸化位点,2个酪氨酸磷酸化位点;同源性分析显示,双峰驼β-NGF的核苷酸序列与单峰驼、羊驼、野猪、山羊、马、黄牛、人、犬、家鼠及家兔的同源性分别为99.6%,99.0%,92.8%,92.6%,91.7%,91.0%,89.5%,89.1%,84.4%,83.7%;IHC结果显示,β-NGF在双峰驼的下丘脑细胞、垂体嗜色细胞和嫌色细胞、卵巢粒细胞、膜细胞和间质细胞、子宫内膜腺上皮细胞和输卵管黏膜上皮细胞均有阳性反应;qRT-PCR结果显示,β-NGF在子宫角中表达量最高,且极显著高于其他组织(P<0.01);Western blot结果显示,β-NGF蛋白在子宫角中表达量最高,且极显著高于下丘脑和输卵管(P<0.01),显著高于垂体(P<0.05)。结果表明,本试验成功克隆出双峰驼β-NGF基因的CDS区,其保守性较高,且该蛋白二级结构有3种折叠方式;β-NGF在子宫角表达水平较高,提示β-NGF可能通过子宫内膜参与了双峰驼的诱导排卵过程。

    2022年11期 v.42;No.311 2242-2249页 [查看摘要][在线阅读][下载 4925K]
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研究论文_临床兽医学

  • NEFA经MMPs途径对奶牛子宫内膜上皮细胞Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

    邢菲菲;罗胜缤;温小庆;曹一鸣;李美娟;罗春海;付世新;

    为了研究体外非酯化脂肪酸(NEFA)对奶牛子宫内膜上皮细胞基质金属蛋白酶(MMPs)、Ⅳ型胶原蛋白(COL-Ⅳ)和炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α)分泌的调节作用,进而探讨NEFA对奶牛胎衣不下(RFM)发生的影响,使用不同浓度的NEFA刺激牛子宫内膜上皮细胞,采用qPCR和Western blot检测细胞中MMP-2、MMP-9、COL-Ⅳ、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平。结果表明,与对照组相比,低浓度组和高浓度组的MMP-2和COL-Ⅳ的mRNA表达极显著升高(P<0.01),MMP-9的mRNA极显著下调(P<0.01);IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达在高浓度组均极显著上调(P<0.01),在低浓度组,IL-6的mRNA被极显著上调(P<0.01),IL-8和TNF-α的mRNA被显著上调(P<0.05)。Western blot的结果显示,与对照组相比,高浓度组的MMP-2和COL-Ⅳ的蛋白表达极显著上升(P<0.01),MMP-9的蛋白表达显著下降(P<0.05)。结果证实,NEFA可通过调控MMPs、胶原蛋白和炎性因子调控ECM的降解,从而影响RFM的发生。

    2022年11期 v.42;No.311 2250-2255页 [查看摘要][在线阅读][下载 1006K]
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  • 全反式视黄酸在牛前脂肪细胞增殖及分化中的作用

    范云珲;逯璐;许秋实;郑晰丹;杨童;徐闯;

    奶牛前脂肪细胞的增殖与分化对于正常脂肪组织发育至关重要。本研究旨在细胞水平探讨全反式视黄酸(ATRA)对牛前脂肪细胞的增殖与分化。试验分为2组,分别是试验组(牛前脂肪细胞用20 nmol/L ATRA处理48 h)及对照组。用MTS及EdU及Ki67法检测ATRA对牛前脂肪细胞增殖的影响,免疫蛋白印记(Western blot)检测ATRA对牛前脂肪细胞中几种增殖相关蛋白表达的影响,包括细胞周期蛋白D1(CCND1)、2、3和CCNE1及细胞周期蛋白激酶(CDK2、4、6);使用流式细胞术检测细胞周期进程,并检测分化相关指标PPARγ和C/EBPα蛋白表达情况。结果显示,与对照组相比,20 nmol/L ATRA可抑制牛前脂肪细胞增殖,同时降低S期细胞比例并降低细胞周期蛋白(CCND1、CCND2、CCND3和CCNE1)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2、CDK4和CDK6)的蛋白丰度。此外,与对照组相比,ATRA的添加还通过下调PPARγ和C/EBPα的蛋白质表达来抑制牛前脂肪细胞的分化。结果表明,20 nmol/L ATRA处理48 h会抑制牛前脂肪细胞的增殖与分化,对正常脂肪组织发育具有潜在作用。

    2022年11期 v.42;No.311 2256-2260+2291页 [查看摘要][在线阅读][下载 621K]
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研究论文_动物科学

  • 基于转录组测序对剑白香猪黑色素生成相关基因的筛选与分析

    覃海;陈伟;毕欢;袁巍;周萍;

    毛色作为猪的品种特征,有着重要的研究意义。本研究为筛选剑白香猪黑色素生成相关基因,通过转录组测序技术对贵州剑白香猪黑色被毛皮肤和白色被毛皮肤进行转录组测序,并运用qRT-PCR和免疫组化技术验证测序结果。结果识别差异表达基因1 230个,其中相较于白色被毛皮肤组织而言,黑色被毛皮肤组织中上调基因有738个,下调基因有492个,包括与黑色素合成相关基因,如酪氨酸酶基因(tyrosinase, TYR)、酪氨酸相关蛋白1基因(tyrosinase-related protein1,TYRP1)、多巴色素异构酶(dopachrometautomerase, DCT)、黑色素A基因(melan-A,MLANA)等,且这些基因在剑白香猪黑色被毛皮肤中的表达量显著高于白色被毛皮肤。基因本体(gene ontology, GO)分析发现共有1 070个差异表达基因显著富集于9个GO term,包括蛋白降解(proteolysis)、生物调节(regulation of biological quality)、细胞连接复合体(extracellular matrix organization)、细胞质(cytoplasm)、细胞核(nucleus)及ATP结合(ATP binding)等。KEGG通路分析表明酪氨酸代谢和黑色素合成通路显著富集,黑色素合成通路和酪氨酸代谢通路与剑白香猪毛色形成密切相关,参与黑色素合成通路的有TYRP1、TYR、DCT、WNT10B、WNT16、WNT3、WNT11、CREB3L2等11个差异表达基因,参与酪氨酸代谢通路的基因有TYRP1、TYR、DCT、AOX1。经qRT-PCR对TYR、TYRP1、DCT、SLC45A2、MLANA等部分基因验证,基因表达变化情况与转录组测序结果一致;进一步通过组织化学染色方法对剑白香猪皮肤中MITF和TYR基因的蛋白表达水平进行分析,MITF和TYR蛋白在香猪黑色被毛皮肤中的表达量均高于白色被毛皮肤,表明测序结果准确。通过SNP分析发现在剑白香猪白色被毛皮肤组织测序结果中,SLC45A2和TYRP1基因存在错义突变的SNP,SLC45A2有2个错义突变的SNP位点:Exon1-g.229G>A和Exon1-g.13499A>G;TYRP1有1个错义突变的SNP位点:Exon7-g.17261A>G。研究结果提示,剑白香猪中TYRP1、TYR、DCT、SLC45A2、MLANA、PMEL、WNT10B、WNT16、WNT3、WNT11、CREB3L2等基因的下调可能是造成剑白香猪白色被毛的原因之一,揭示酪氨酸代谢和黑色素合成信号通路在剑白香猪毛色表型形成中发挥了重要作用,SLC24A5和TYRP1基因的突变也可能影响剑白香猪的毛色。本研究为剑白香猪不同毛色皮肤组织基因表达谱提供了新的信息,为探究猪毛色性状的遗传机制及分子标记育种提供了基础材料。

    2022年11期 v.42;No.311 2261-2271+2283页 [查看摘要][在线阅读][下载 5677K]
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  • 栀子对产蛋后期蛋鸡生产性能和蛋品质的调控作用及其机制

    王衡;林惠莹;孙倩倩;马玉芳;李健;

    旨在研究日粮中添加不同质量分数(1.0%,1.5%,2.0%)栀子对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质、血清生殖激素以及肝脏和卵巢中卵黄沉积与卵泡发育相关基因表达的影响。试验选取144只360日龄健康状态良好的海兰褐蛋鸡,随机分为4组,每组6个重复,每个重复6只。空白组饲喂基础日粮,各试验组在基础日粮中添加相应质量分数的栀子粉,预饲期2周,试验期8周。试验期间以重复为单位,每天记录产蛋数和蛋质量,每2周随机选取蛋样测定蛋品质;于第0,4,8周末进行翅下静脉采血,以测定血清生殖激素水平;试验结束时,每个重复选取3只鸡常规处死,采集肝脏和卵巢组织,用于制作石蜡切片观察组织形态结构和荧光定量PCR分析相关基因表达量。结果表明,2.0%栀子组的产蛋率和平均蛋质量显著提升(P<0.05);各栀子组蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳质量差异不显著,但1.5%,2.0%栀子组的蛋黄颜色在试验全程均显著加深(P<0.05),2.0%栀子组哈夫值和蛋黄比率在第4和8周显著增加(P<0.05);第8周各栀子组血清E2、P4、FSH、LH水平明显升高(P<0.05或P<0.01);各栀子组中,试验鸡肝脏PPARγ、ApoVLDL、ApoB、FAS、ACC、SREBP-1c基因,以及卵巢AR、CYP17、CYP19、ESR2、FSHR、LHR基因的表达存在不同程度的升高。综上所述,日粮中添加栀子粉能提高产蛋后期蛋鸡生产性能、改善蛋品质,其调控作用可能是通过加快肝脏卵黄沉积、调节生殖激素分泌和促进卵泡发育来实现。

    2022年11期 v.42;No.311 2272-2283页 [查看摘要][在线阅读][下载 8161K]
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  • 基于RNA-Seq高通量测序技术对肉牛下丘脑基因表达分析及新基因挖掘研究

    雷虹;孙鏖;胡雄贵;李付强;张爽;易康乐;

    通过对9头不同月龄的安格斯母牛下丘脑组织进行转录组测序和生物信息学比较分析,筛选和挖掘与肉牛生长、繁殖活动相关候选基因和信号通路。通过转录组测序,进行表达基因分析、GO和KEGG富集分析以及信号通路筛选。结果显示,共获得59.74 Gb clean data,各组的样品clean data均达到6.64 Gb, Q30碱基百分比平均在94.60%及以上。有18 979个基因在所有组织中都有表达,有1 706个基因只在2个月龄段下丘脑组织中共同表达,有2 149个基因只在其中的1个月龄段下丘脑组织中表达。在所有下丘脑所表达的基因中,GO、KOG和KEGG数据库得到注释的分别为2 621,12 930和13 453个。在所有KEGG通路中,血管内皮生长因子信号通路、Notch信号通路和Hippo信号通路在各年龄段下丘脑组织中检出频率最高,说明这些信号通路可能通过下丘脑和性腺轴对母牛生殖活动产生影响。

    2022年11期 v.42;No.311 2284-2291页 [查看摘要][在线阅读][下载 4562K]
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  • 甘加型藏羊发情周期Kiss-1/GPR54在生殖器官中的表达和分布

    孙晓煜;何玉英;杨亚文;何玉琴;包莹莹;刘莉莉;陶乐凯;蔡永强;

    为阐明高原甘加藏羊(Ovis aries)发情周期Kiss-1/GPR54在生殖器官中的表达及其对藏羊繁殖调控的影响,选取30只处于发情周期和乏情期的甘加藏羊,分别应用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色等方法研究了发情周期和乏情期卵巢、输卵管和子宫组织中Kiss-1、GPR54 mRNA及其蛋白含量的表达和分布。结果表明,Kiss-1、GPR54 mRNA及其蛋白在发情周期和乏情期的卵巢、输卵管和子宫中均有表达,发情周期卵巢中Kiss-1、GPR54 mRNA及其蛋白相对表达量在发情期达到最大值,各时期差异显著(P<0.05);子宫中Kiss-1 mRNA及其蛋白在间情期表达量最高,显著高于发情周期其他3个时期(P<0.05);GPR54 mRNA及其蛋白在发情期相对表达量显著高于其他时期(P<0.05);输卵管中Kiss-1、GPR54 mRNA在发情期达表达量最高,而Kiss-1、GPR54蛋白在发情前期表达量达到最高,显著高于其他时期(P<0.05)。乏情期Kiss-1、GPR54 mRNA及其蛋白的表达显著低于发情周期各时期,差异显著。免疫组织化学染色结果显示,Kisspeptin和GPR54的免疫阳性产物在卵巢中主要分布在卵泡颗粒层以及卵泡膜上,在输卵管中主要在黏膜上皮的纤毛细胞、分泌细胞中表达,在子宫中主要在上皮细胞和基质细胞中表达;说明两者参与甘加藏羊生殖生理活动,并可能对其产生一定的调控作用。

    2022年11期 v.42;No.311 2292-2298页 [查看摘要][在线阅读][下载 8031K]
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  • 绵羊骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定

    楼梦雨;潘欠欠;敬敬;韦进波;万赛罗;凌英会;

    旨在分离绵羊骨髓间充质干细胞(sheep bone marrow mesenchymal stem cells, SBMSC),建立绵羊骨髓间充质干细胞系,为相关研究提供种子细胞。取新生健康绵羊肋骨为试验材料,利用贴壁法分离获得SBMSC;取生长良好的P3代细胞通过免疫荧光,进行CD73、CD90、CD105、CD106表型鉴定;取生长良好的P3代细胞分别进行成软骨、成脂、成骨方向的诱导,对诱导结果分别进行阿利新蓝、油红O和茜素红染色,鉴定分化结果。SBMSC呈成纤维样贴壁生长;体外培养P3代细胞表面标记物CD73、CD90、CD105和CD106完全符合标准;P3代细胞经软骨、脂肪、骨方向诱导3周后,经阿利新蓝染色,细胞呈亮蓝色;经油红O染色,细胞质内出现橙红色脂滴;茜素红染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节。说明SBMSC经体外诱导培养后可向软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞分化,并具有明显的成软骨、成脂和成骨表型,表明SBMSC具有多向分化潜能。通过贴壁培养法建立了SBMSC完整的体外培养体系,为绵羊育种等方面提供种子细胞。

    2022年11期 v.42;No.311 2299-2304页 [查看摘要][在线阅读][下载 5789K]
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  • 鹿茸根部骨化组织可溶性钙提取工艺优化及钙转运效果评价

    翟晓瑞;巩永博;吕伟;李雨果;魏豪杰;程蓉英;刘松财;张英;郝林琳;张一宁;

    采用酸溶法提取鹿茸根部骨化组织中可溶性钙,探究不同酸种类、酸用量、提取时间、提取温度对鹿茸根部骨化组织可溶性钙含量的影响,通过正交试验优化骨钙提取的最佳工艺条件,检验不同浓度骨钙对Caco-2细胞的毒性作用,并构建Caco-2模型模拟体内肠道吸收环境,研究骨钙的转运效率。结果表明,最佳提取条件即苹果酸提取,酸用量为5%,提取温度为55℃,提取时间为70 min时,骨钙含量为(6.136±0.015) mg/g。体外模拟结果表明,骨钙对Caco-2细胞呈现低毒性作用且转运效率为CaCl_2的2倍左右。该研究为开发新的钙源和提高鹿茸根部骨化组织的附加值提供了新的发展方向。

    2022年11期 v.42;No.311 2305-2309页 [查看摘要][在线阅读][下载 471K]
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综述

  • NO信号分子对精子功能的影响

    周佳勃;吴桐;林敬轶;刘雪;边小琪;李丹彤;岳顺利;

    一氧化氮(NO)是一种活性氮物质(reactive nitrogen substance, RNS),参与多种雄性生殖过程。近年来研究表明:NO在精子发生、功能改善、获能、凋亡和受精等一系列生理过程中发挥了重要作用。NO具有双重性,既是细胞毒性分子,也是维持精子正常生理功能的关键分子。过量的NO对精子是有害的。NO通过多种通路调节精子的功能,对维持精子各种生理过程的稳定有着重要作用。现总结近年来关于NO对精子功能影响的研究进展,以期为改善精子功能,提高受精率等生殖生物学研究提供参考。

    2022年11期 v.42;No.311 2310-2314页 [查看摘要][在线阅读][下载 167K]
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  • 猪圆环病毒2型分子流行病学研究进展

    高小鹏;罗胜军;徐麟;王泽岩;高原;向华;陈晶;黄元;白挨泉;王晓虎;

    猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)是引起猪圆环相关疾病的主要病原体,在猪场中普遍存在,是严重影响全球养猪业经济效益的重要疫病。我国自2000年首次报道以来,已鉴定多个基因型。为了解我国PCV2分子流行病学及各基因型的时空分布,本研究通过整理了2010-2020年间国内外相关文献,对各地区的PCV2感染率及其基因型进行统计和分析,为掌握我国PCV2分子流行学情况提供了具体数据,对我国PCV2的防控也具有一定借鉴和指导意义。

    2022年11期 v.42;No.311 2315-2321页 [查看摘要][在线阅读][下载 1287K]
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  • 应激对畜禽肝脏结构及功能的影响

    聂君书;陈卓;胡惠洁;徐晶;李东倪;刘萌萌;张思淼;徐彬;郭景茹;

    肝脏作为机体重要的消化腺以及代谢稳态的中枢器官,容易受到不同应激反应的影响。应激能够造成畜禽肝脏组织损伤与功能紊乱,进而导致生产性能降低以及抗病能力减弱。随着现代畜牧行业的扩大,应激带来的危害与影响是不可忽视的。本文将从应激对畜禽肝脏组织与功能的影响及机制等方面进行综述,为今后对减少应激损伤的研究提供理论依据。

    2022年11期 v.42;No.311 2322-2325+2336页 [查看摘要][在线阅读][下载 168K]
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  • 苦马豆素历史、来源及生物活性研究进展

    黄睿杰;马永嘉;赵世姣;王帅;吴晨晨;路浩;赵宝玉;

    苦马豆素是一种含羟基吲哚里西啶生物碱,从发现命名至今已经有40多年的历史,起初被确证是疯草类有毒植物的毒性成分,研究重点主要是侧重其毒性与毒理方面,证实苦马豆素可特异性的抑制动物机体α-甘露糖甘酶活性,导致细胞溶酶体甘露聚糖蓄积,造成细胞空泡变性,引起器官组织损伤和神经功能障碍。随着研究的深入,人们又发现苦马豆素具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等生物活性,从此掀起了苦马豆素药理作用研究的热潮,引起人类医学研究领域学者的关注和极大兴趣。现根据国内外苦马豆素相关研究文献,从其研究历史、主要来源、毒性与毒理及药理活性等方面进行归纳总结,并对今后的研究方向进行展望,以期为人们较全面地掌握苦马豆素的历史、最新研究进展、以及科学认识苦马豆素的两重性提供重要理论参考。

    2022年11期 v.42;No.311 2326-2336页 [查看摘要][在线阅读][下载 285K]
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简讯

  • 《中国兽医学报》发展大事记

    <正>《中国兽医学报》的前身可追溯到创刊于1972年的《兽医参考资料》,由当时的解放军兽医大学主办,为不定期普及性的部队内部刊物。《兽医参考资料》1980年年底停刊,在9年的时间内共出刊52期。编辑工作主要由我国著名的兽医病理学家叶重华教授担任。1981年3月,经国家和军队相关单位批准,《兽医大学学报》正式创刊,当时为季刊,内部发行,由中国人民解放军总后勒部主管,解放军兽医大学主办,学报工作主要由祝玉琦教授负责。

    2022年11期 v.42;No.311 2337-2338页 [查看摘要][在线阅读][下载 72K]
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