- 袁嘉康;李林岳;庞俊增;范国英;姜金庆;王自良;李任峰;
将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)与侧流层析试纸(lateral flow dipstick, LFD)技术相结合，根据猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)M基因保守序列设计特异性引物，上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(biotin)标记，通过优化RPA反应温度和时间条件，建立基于RPA-LFD的PEDV快速检测方法，并对该方法的灵敏性、特异性和临床应用进行评价。结果显示，该方法在40.8℃恒温反应21 min即可完成对PEDV核酸的扩增，RPA-LFD的最低检测限为1.27×10~(2 )拷贝/μL,且与猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应；22份临床样本检测结果显示RPA-LFD与RT-PCR检测结果完全一致。结果表明，本试验建立的PEDV RPA-LFD检测方法具有操作方便、检测速度快、灵敏度高、特异性强等优点，为PEDV的现场快速检测和流行病学调查提供了新的技术手段。
2023年06期 v.43;No.318 1127-1132页 [查看摘要][在线阅读][下载 298K] [下载次数：548 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：1 ] - 陈羽璇;张鑫杰;吕紫欣;薛少华;刘小梅;黄喜荣;蒙宁;邱飞铭;许雨航;俞国华;杨小燕;戴爱玲;
根据6型猪细小病毒(porcine parvovirus 6,PPV6)和4型猪细小病毒(porcine parvovirus 4,PPV4)全基因组的保守区域基因序列，分别设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的Taqman探针。经过条件优化，建立能够同时诊断PPV6和PPV4的双重荧光定量PCR方法，并对其特异性、灵敏性、稳定性以及与常规PCR方法的符合率进行研究。结果显示，该方法能够同时检测鉴别PPV6和PPV4,且特异性良好，与猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及猪细小病毒1型核酸均无交叉反应；本方法灵敏性强，PPV6和PPV4的最小检出限分别为7.7拷贝/μL和9.3拷贝/μL;组间和组内变异系数均未超过2%,具有良好的重复性；利用所建立的双重荧光定量PCR方法对福建省采集的68份猪血清及20份组织样本进行检测，PPV6阳性率为37.5%(33/88),PPV4阳性率为12.5%(11/88),混合感染率为11.36%,该结果与常规PCR的符合率分别为81.8%(PPV6),90.9%(PPV4)和90.05%(混合感染率),并且常规PCR鉴定的阳性样品通过本研究建立的方法复检时均未出现漏检。结果表明，本试验建立的检测方法对PPV6和PPV4的鉴别诊断、病原监测、流行病学调查等具有重要意义。
2023年06期 v.43;No.318 1133-1138+1161页 [查看摘要][在线阅读][下载 629K] [下载次数：246 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：2 ] - 陈芯羽;刘钟元;孙文超;赵翠青;白杰英;李昌;刘立明;
为研究广西地区猪hokovirus(PHoV)又称猪PARV4 (P-PARV4)毒株流行情况和遗传进化特征，对采自广西地区猪组织样品进行检测，扩增出其中1株全基因序列，命名为YL172(GenBank登录号：KX827773)。感染率调查结果显示，广西地区成年猪P-PARV4感染率为95.0%。同源性分析结果显示，P-PARV4 YL172株全基因组与喀麦隆、欧洲、美国和中国参考株同源性为96.1%～99.3%;YL172株NS1基因与参考株同源性为97.0%～99.5%;YL172株VP2基因与参考株同源性为93.4%～99.1%。VP2遗传进化分析结果显示，P-PARV4分离株存在2个亚群，YL172株与中国参考株GX1、SH1、JSNJ处在同一进化分支，而美国参考株US-HK133与HK1则处在另一进化分支。
2023年06期 v.43;No.318 1139-1144页 [查看摘要][在线阅读][下载 1353K] [下载次数：125 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 南文龙;巩明霞;陆游;李金明;王永杰;哈达;李林;杜秋明;陈义平;吴晓东;
将GenBank中牛结节性皮肤病病毒与同属的山羊痘病毒和绵羊痘病毒全基因组进行比较，筛选设计特异性引物和探针，建立Cycleave PCR检测方法。结果显示，建立的方法在40 min内即可特异性地检出牛结节性皮肤病病毒核酸，与山羊痘病毒、绵羊痘病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒均无交叉反应，该方法的最低检出限为1.13拷贝/μL。平行检测89份临床样本，与国标荧光定量PCR方法相比，本方法敏感性100.0%,特异性90.0%,总符合率为95.5%。结果表明，本试验建立的Cycleave PCR检测方法敏感、特异且操作简便，适用于牛结节性皮肤病病毒的高通量、快速检测。
2023年06期 v.43;No.318 1145-1148+1174页 [查看摘要][在线阅读][下载 273K] [下载次数：198 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 李艳超;郝香琪;周沛;
利用新型CRISPR interference(CRISPRi)技术进行蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)目的基因PERK的敲低。首先，利用慢病毒包装系统经嘌呤霉素筛选后构建稳定表达dCas9-KRAB蛋白的MDCK细胞株。然后，设计靶向PERK转录起始位点(transcription start site, TSS)的特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),向该稳转细胞株转染表达sgRNA的质粒，通过qPCR检测PERK的mRNA表达水平；同时，内质网应激激活剂衣霉素(tunicamycin, Tu)处理该细胞后，通过qPCR检测PERK通路下游GRP78、GRP94、ATF4、GADD34和CHOP等基因mRNA的表达水平。最后，将犬细小病毒2型(canine parvovirus type 2,CPV-2)接种于PERK敲低的MDCK细胞株，通过绝对定量PCR测定不同时间点CPV-2的复制水平。结果表明，敲低PERK基因表达后，CPV-2的复制水平显著下降，说明PERK参与调控CPV-2的复制。以上结果为进一步探究内质网未折叠蛋白反应(endoplasmic reticulum unfolded protein response, UPR~(ER))对CPV-2复制的影响及病毒与宿主相互作用的分子机制研究奠定了基础。
2023年06期 v.43;No.318 1149-1155页 [查看摘要][在线阅读][下载 478K] [下载次数：148 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 孙文杰;宋亚鹏;刘琳;赵振超;陶明月;董松岭;高文明;李新生;
根据鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus, CIAV) HN1415流行株基因组序列(GenBank登录号：MZ668717)设计、合成1对特异性引物及TaqMan探针，经敏感性、特异性以及批内、批间可重复性检验对该方法进行验证。结果显示：该方法灵敏，10拷贝/μL病毒即可检出；特异性强，与FAdV-4、IBDV、AIV、IBV、ALV以及NDV等临床常发禽类传染病病原均无交叉反应；重复性好，批内及批间变异系数均小于1%。结果表明，本试验成功建立了检测CIAV的TaqMan荧光定量PCR方法。用该方法对采自中国不同养鸡地区的253份疑似CIAV感染病例进行检测，阳性检出率在41.18%～62.50%之间，其中广东省的阳性检出率最低(41.18%),山东省阳性检出率最高(62.50%)。对阳性检出样品随机测序验证结果显示，本试验建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法可快速、准确检出CIAV,为CIAV的快速确诊提供了重要工具。
2023年06期 v.43;No.318 1156-1161页 [查看摘要][在线阅读][下载 309K] [下载次数：441 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：3 ] - 刘世佳;尚宵敏;王浩;周睿;李博硕;孙晰瑶;韩静静;杜恩岐;
选取禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)JLJ13株的fiber-2和penton蛋白作为保护性抗原，利用SWISS-MODEL网站对fiber-2蛋白空间结构进行模拟，截取其主要功能区fiber-2-Shaft 2替代fiber-2,进行密码子优化后，将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白基因序列克隆到pET28a(+)载体上并送至北京天一辉远生物科技有限公司进行基因合成，将合成的质粒分别命名为pET-28a-msyb-fiber-2-Shaft 2和pET-28a-msyb-penton。通过原核表达系统进行蛋白表达并使用镍柱纯化。经BCA定量后，用PBS分别将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白质量浓度稀释至1 000,500,250 mg/L,再将相同质量浓度的fiber-2-Shaft 2和penton蛋白按1∶1体积比混合后作为抗原，配伍ISCOMs佐剂，0.2 mL/只免疫30日龄SPF鸡，即高剂量组免疫fiber-2-Shaft 2和penton蛋白各100μg、中剂量组各50μg、低剂量组各25μg。一免后14 d进行二次免疫，采集二免后7,14,21 d血清检测特异性抗体和中和抗体，并在二免后21 d攻毒。结果显示，成功表达出fiber-2-Shaft 2和penton蛋白，大小分别为69,93 kDa,镍柱纯化后可获得高纯度的蛋白；二免后14 d高中低量组的中和效价依次为1 280,640,640,攻毒后阴性对照组表现出明显的临床症状，2～3 d后死亡，疫苗组均未出现任何临床症状。结果表明，利用禽腺病毒血清4型JLJ13株fiber-2-Shaft 2和penton蛋白混合配伍ISCOMs佐剂制备的亚单位疫苗免疫保护效果明显。
2023年06期 v.43;No.318 1162-1166+1186页 [查看摘要][在线阅读][下载 347K] [下载次数：352 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：1 ] - 龚乐乐;秦静霖;林树乾;贺秀媛;庄国庆;孙爱军;
从板蓝根多糖(Isatidis Radix polysaccharides, IRPS)对马立克病病毒(Marek?s disease virus, MDV)的增殖抑制、感染阻断以及直接杀灭这3个给药途径探讨IRPS抗MDV作用。利用Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)以及间接免疫荧光(IFA)等试验观察IRPS对病毒复制的影响。结果显示，IRPS剂量依赖性抑制MDV的基因表达、蛋白合成以及降低病毒复制水平。同时，IRPS可以降低IL-6的表达，并促进IFN-β的表达。结果表明，IRPS可能通过降低炎症反应，并且促进干扰素表达而抑制MDV的复制。
2023年06期 v.43;No.318 1167-1174页 [查看摘要][在线阅读][下载 518K] [下载次数：288 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：1 ] - 曲哲会;张喜文;鲁绍芳;陈敏;曾超;李梦莉;焦凤超;何书海;赵瑜;黄立;
设计分别检测鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)、鸭瘟病毒(duck plague virus, DPV)和鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的特异性引物，且PCR产物大小差异明显；优化多重PCR的引物浓度、退火温度，并分析特异性和敏感性；利用多重PCR方法和单一PCR方法对54份临床采集的鸭源病料进行检测。结果显示，该多重PCR检测方法可用于DTMUV、RA和DPV的单纯或混合感染的诊断，PCR产物大小分别为220,308,551 bp;反应体系中最佳引物终浓度组合为1.0μmol/L的引物DTMUV-S和DTMUV-A、0.5μmol/L的引物RA-S和RA-A、0.5μmol/L的引物DPV-S和DPV-A;该检测方法退火温度在46.5～63.8℃之间均可以检测到3种病原体核酸，其中最佳退火温度为57.0℃。该方法检测DTMUV、DPV和RA的核酸最低量分别为6.570,0.600,0.440μg/L。临床样品检测结果显示，本试验建立的DTMUV、DPV和RA多重PCR检测结果与单一PCR检测结果符合率为98.1%。结果表明，本试验建立的复合PCR方法可适用于3种病原体单纯或混合感染的快速诊断，为流行病学调查及快速、准确制定针对性防控措施提供了技术支持。
2023年06期 v.43;No.318 1175-1180页 [查看摘要][在线阅读][下载 354K] [下载次数：460 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：3 ] - 赵光伟;邵骜骏;曹瑞兵;曹蓝云;冯昊南;曹礼静;谭昌藩;杨晓伟;魏思远;张天奇;李军;崔晓焓;张立武;
为了探究鹅星状病毒感染是否存在抗体依赖性增强作用，用中和效价为1∶94、1∶141和1∶282共3种不同抗体滴度(低、中、高效价)的鹅星状病毒卵黄抗体分别进行雏鹅保护试验和鹅胚中和试验，同时设空白对照和攻毒对照。结果显示，雏鹅保护试验中抗体效价1∶94组鹅均发病，病死率90%(9/10),1∶141效价组鹅的发病率为30%(3/10),病死率20%(2/10),1∶282效价组鹅无发病及死亡；攻毒对照组鹅100%发病，病死率80%(8/10);1∶94抗体组动物发病时间和死亡时间均早于攻毒对照组；荧光定量PCR检测结果显示1∶94和1∶141抗体效价组Ct值均小于攻毒对照组。鹅胚中和试验结果显示，3个抗体处理组鹅胚病死率分别为100%,20%和0,攻毒和阴性对照组分别为100%和0,1∶94效价组鹅胚死亡时间显著早于攻毒对照组；荧光定量检测结果显示1∶94效价组平均Ct值显著小于1∶141效价组和攻毒对照组。结果说明低中和效价的鹅星状病毒卵黄抗体能增强鹅星状病毒在雏鹅和鹅胚体内的复制能力，发病率和病死率增加，证实鹅星状病毒感染存在抗体依赖性增强作用，其结果可为临床鹅星状病毒病的防控提供理论依据。
2023年06期 v.43;No.318 1181-1186页 [查看摘要][在线阅读][下载 296K] [下载次数：291 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：2 ] - 刘明;孙长江;顾敬敏;董建宝;韩文瑜;
旨在研制预防以马流产沙门菌(S.abortus equi)和马链球菌兽疫亚种(SEZ)感染引起的孕驴流产和新生驴驹腹泻的驴流产沙门菌病-兽疫链球菌病二联灭活疫苗，并进行安全性与免疫原性评价。从山东某驴场分离和鉴定出的S.abortus equi、SEZ分离株为疫苗候选菌株，经甲醛灭活，分别与氢氧化铝佐剂和角鲨烯佐剂制备驴流产沙门菌病-兽疫链球菌病二联灭活苗。首先，检测灭活疫苗对BALB/c小鼠的安全性，比较2种不同佐剂诱导免疫保护的效果；以驴流产沙门菌病-兽疫链球菌病二联角鲨烯佐剂灭活疫苗免疫驴，凝集试验检测免疫血清的总抗体水平及血清杀菌试验检测功能性抗体水平，进一步评价二联灭活疫苗的免疫原性。结果显示，以氢氧化铝佐剂二联灭活苗免疫对5倍LD_(50 )S.abortus equi和SEZ攻击BALB/c小鼠的保护率分别达到62.5%(5/8)和75.0%(6/8),而角鲨烯佐剂二联灭活疫苗对2种病原的攻击保护率均达到100%(8/8);以角鲨烯佐剂制备的二联灭活疫苗免疫驴的血清中抗流产沙门菌(10~8 CFU/mL)的抗体凝集效价几何平均值可达1∶32,功能性抗体对S.abortus equi和SEZ的血清杀菌效价为1∶16(杀菌效率68.99%)和1∶4(杀菌效率65.47%)。S.abortus equi和SEZ 2种抗原免疫不会产生免疫干扰，角鲨烯配方佐剂与抗原结合诱导的抗S.abortus equi和SEZ致死剂量攻毒产生的保护作用强于氢氧化铝佐剂，且该二联灭活疫苗在小鼠和驴体内具有较强的保护效力与免疫原性，且安全性良好。本研究为该基于新型疫苗佐剂二联疫苗的研发奠定了坚实的基础。
2023年06期 v.43;No.318 1187-1193+1202页 [查看摘要][在线阅读][下载 328K] [下载次数：250 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：1 ] - 刘佳琪;李仕楷;苏文楠;陈亦杏;钟嘉诚;张溢珊;陈济铛;朱婉君;张济培;
对2020年7月至2021年6月临床症状与病理剖检初步诊断为鹅坏死性肠炎疑似病例肠道内容物和肝脏进行细菌分离并纯化，获得52株菌。分离菌株经培养特性、生化试验、种特异性PCR鉴定，确定52株菌均为产气荚膜梭菌；采用PCR对分离株毒素基因鉴定，结果显示分离株均为毒素型A型，其中cpβ_2基因的检出率为61.5%,未检测到肠毒素cpe基因和netB毒素基因。药敏试验结果显示，分离株对头孢噻肟(100%)、头孢噻呋(100%)、氟苯尼考(100%)和多西环素(94%)表现为高度敏感，其次为恩诺沙星(88%)和氧氟沙星(88%);而耐药率最高的药物为磺胺类药物，其中磺胺甲恶唑耐药率为100%,其次是林可胺类药物，林可霉素与克林霉素耐药率分别为58%和46%;中药体外抑菌试验结果显示，单味中药黄连、黄柏、黄芩和复方中药乌梅散、白头翁汤、郁金散对产气荚膜梭菌均有一定的抑菌作用，其中黄连的MIC值为1.57 g/L,远低于其他试验中药的MIC值，具有较强的抑菌作用。本试验为广东省主要鹅养殖区域鹅产气荚膜梭菌病的有效防治提供了参考依据。
2023年06期 v.43;No.318 1194-1202页 [查看摘要][在线阅读][下载 878K] [下载次数：564 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：1 ] - 闫宗斌;张国帅;金春梅;于龙政;薛书江;宋建臣;许应天;
人工合成一种细胞穿膜肽，制备穿膜肽-DNA疫苗复合物，先将其转染Vero细胞，采用间接免疫荧光抗体试验(IFTA)鉴定目的基因在Vero细胞中的表达；再将40只6周龄雌性昆明小鼠分为CPPs-pVAX1-P33、pVAX1-P33、pVAX1和PBS 4个组；分别肌肉注射相应免疫原，采用ELISA方法检测CPPs血清中IgG抗体水平和IL-4、IFN-γ细胞因子水平；在三免2周后检测小鼠脾脏中CD3~+、CD4~+和CD8~+含量。结果显示，CPPs-pVAX1-P33复合物成功转染到Vero细胞，并在其中获得表达；CPPs-pVAX1-P33免疫组昆明小鼠血清中IgG抗体水平，IL-4和IFN-γ细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD3~+、CD4~+、CD8~+含量均显著或极显著高于pVAX1-P33(P<0.05或P<0.01)。结果表明，本试验制备的CPPs能显著诱导瑟氏泰勒虫DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫应答反应。
2023年06期 v.43;No.318 1203-1207页 [查看摘要][在线阅读][下载 397K] [下载次数：86 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ]
- 鲁文赓;谢何昕;田春雨;范钊;姚旭东;韩双印;张思宇;金吉东;韩英浩;
用0.0,0.1,1.0,10.0μmol/L的LPS分别处理奶牛子宫内膜上皮细胞(bovine endometrial epithelial cells, BEECs)0,3,6,12,24 h后，通过qPCR检测炎性细胞因子的表达，继而筛选LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎症模型的最佳条件，随后通过使用孔径为0.4μm的transwell构建间接共培养体系，进而分析BEECs细胞焦亡相关蛋白的表达水平。qPCR试验结果显示，LPS在浓度为0.1μmol/L刺激12 h时所构建的细胞损伤模型最佳；流式细胞术结果显示，当利用0.1μmol/L的LPS刺激12 h时，BEECs的细胞焦亡明显增强(P<0.01),而在LPS处理后与奶牛脂肪间充质干细胞(bovine adipose-derived mesenchymal stem cells, bAD-MSCs)共培养组中，BEECs的焦亡随共培养的时间增加而减少(P<0.05);Western blot结果显示LPS处理后BEECs中Caspase-3、GSDMD、AIM2和Caspase-1蛋白水平显著增强(P<0.05),与bAD-MSCs共培养组中的细胞内Caspase-3、GSDMD、AIM2和Caspase-1蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结果表明，用LPS构建BEECs细胞焦亡损伤模型的最佳条件为0.1μmol/L的LPS处理12 h,阐明了bAD-MSCs通过下调GSDMD、Caspase-3、AIM2和Caspase-1蛋白表达而抑制LPS诱导BEECs焦亡。
2023年06期 v.43;No.318 1228-1233+1303页 [查看摘要][在线阅读][下载 542K] [下载次数：147 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 李卓悦;罗通旺;郁孝强;王晓杜;宋厚辉;邵春艳;
用4μmol/L氯化镉处理大鼠肝脏细胞BRL-3A 12,24,36 h后，通过CCK-8法测定细胞活力，比色法检测细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量，流式细胞术检测细胞中活性氧(ROS)的含量及线粒体膜电位水平，比色法检测细胞中氧化还原相关指标丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的变化，Western blot检测铁死亡相关蛋白的表达，荧光探针法检测细胞中亚铁离子(Fe~(2+))的含量，电子显微镜观察细胞的超微结构。结果显示，镉(Cd)处理后，BRL-3A细胞活力下降，LDH水平显著升高；ROS、MDA、GSH、GSSG和Fe~(2+)含量极显著增加(P<0.01),FTH1、TfR1、HO-1蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),GPX4蛋白表达水平极显著下降(P<0.01),SLC7A11蛋白水平变化不显著，细胞线粒体萎缩变小、嵴减少或消失。结果表明，Cd处理可致BRL-3A细胞发生脂质过氧化物和Fe~(2+)的蓄积，GPX4水平下降，从而介导细胞发生铁死亡。
2023年06期 v.43;No.318 1234-1241页 [查看摘要][在线阅读][下载 830K] [下载次数：305 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 邵玉桃;李新;张旭;李建华;张西臣;宫鹏涛;王晓岑;
对新孢子虫过氧化物酶1(NcPrx1)重组蛋白(rNcPrx1)进行原核表达并分析其在新孢子虫速殖子和外分泌抗原中的表达情况；通过细胞增殖与毒性试验、ELISA和Western blot等多种手段筛选rNcPrx1安全质量浓度，检测rNcPrx1刺激巨噬细胞后促炎细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的分泌水平，TLR2、以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B(AKT)信号通路相关蛋白表达及磷酸化水平的变化情况等；进一步利用TLR2~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞和相关通路抑制剂明确rNcPrx1调控细胞因子分泌的信号通路。结果显示：成功构建pET-28a-NcPrx1原核表达载体，并纯化获得大小为28 kDa的rNcPrx1蛋白；免疫小鼠获得NcPrx1多克隆抗体，发现该蛋白可分泌于新孢子虫外分泌抗原中。rNcPrx1刺激小鼠腹腔巨噬细胞的安全质量浓度为20 mg/L,该质量浓度的rNcPrx1增加了TLR2的转录水平和表达水平，促进了IL-6、IL-12和TNF-α的分泌量，并显著提高小鼠腹腔巨噬细胞p38、ERK及AKT蛋白的磷酸化水平。与野生型小鼠腹腔巨噬细胞相比，TLR2缺失降低了细胞中IL-6、IL-12和TNF-α的分泌；此外，rNcPrx1刺激细胞后，p38、ERK和AKT的磷酸化水平在TLR2~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞中降低；p38、ERK和AKT抑制剂抑制rNcPrx1诱导的IL-6、IL-12和TNF-α分泌量。结果表明，新孢子虫NcPrx1能够通过TLR2激活MAPK和AKT信号通路，从而诱导小鼠巨噬细胞IL-6、IL-12和TNF-α的分泌，为阐明NcPrx1蛋白功能及宿主抗新孢子虫免疫提供了重要参考。
2023年06期 v.43;No.318 1242-1249+1332页 [查看摘要][在线阅读][下载 751K] [下载次数：323 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：2 ] - 许国洋;谢三磊;沈克飞;郑华;余远迪;牟豪;杨柳;白运川;翟少钦;
利用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中获得山羊γ-干扰素全长基因，进行基因序列分析后，将其克隆pCDNA3.1,构建重组表达质粒pCDNA3.1-CapIFN-γ,经脂质体转染至羊肾细胞中，并进行目的蛋白的SDS-PAGE和Western blot鉴定，分析CapIFN-γ重组蛋白的表达情况。利用细胞病变抑制法测定CapIFN-γ重组蛋白对羊痘病毒的抗病毒活性。结果显示，扩增的CapIFN-γ基因序列全长为501 bp,共编码166个氨基酸，其中前23位氨基酸为信号肽序列，CapIFN-γ的α-螺旋和无规则卷曲含量较高，羊肾细胞表达的目的蛋白约为25 kD,通过对CapIFN-γ的抗病毒活性检测，发现其对羊痘病毒的增殖具有一定抑制作用，其抗病毒活性为2.2×10~(3 )U/mL。本研究利用羊肾细胞成功表达了CapIFN-γ重组蛋白，并对其活性进行了初步分析，为真核表达系统获取的CapIFN-γ抗病毒作用机制的深入研究和抗山羊病毒病产品研发奠定了基础。
2023年06期 v.43;No.318 1250-1256页 [查看摘要][在线阅读][下载 605K] [下载次数：138 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 张华韵;蔡欢嫦;任静强;
利用巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)启动子，以pUC57质粒为骨架，设计了一种多启动子的三独立表达框载体pCMV-3MCS。为验证所构建的质粒系统，在3个表达框中依次插入绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)、红色荧光蛋白(mCherry)、蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein, BFP),转染293细胞后，在荧光显微镜下可观察到明显的绿、红、蓝三色荧光。为更广泛的应用所设计的表达系统，将犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)的N、P和L基因依次插入表达框中，与携带EGFP的病毒mini基因组(EGFP反向插入mini基因组)共转染后，可观察到明显的荧光。结果表明，利用pCMV-3MCS载体可以使N、P、L蛋白通过单质粒转染实现各自蛋白表达，可以容纳近10 kb的外源基因插入，且功能不受影响。这为多质粒共转染转变为单质粒转染提供参考，也为进一步提高副黏病毒的拯救效率提供新的思路。
2023年06期 v.43;No.318 1257-1262页 [查看摘要][在线阅读][下载 487K] [下载次数：101 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 张良;黄家荣;孙志伟;李慧萍;刘淑英;
绵羊肺腺瘤(ovine pulmonary adenocarcinoma, OPA)是一种由绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)引起的慢性、接触传染性肺脏肿瘤疾病。为了探究细胞凋亡在OPA发展过程中的作用，本研究利用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等方法检测了凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3及其对应的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在健康和自然感染JSRV绵羊肺组织中的表达情况。结果显示：与对照组相比，OPA肺组织中Bcl-2基因和蛋白表达量均显著上调，而Bax和Caspase-3基因和蛋白表达量均显著下调。此外，免疫组织化学显示，Bcl-2、Bax、Caspase-3主要表达于腺瘤灶内增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞中。结果表明，细胞凋亡在OPA肺组织中的活动受到抑制，提示绵羊肺腺瘤病毒可能通过调节细胞凋亡活动影响OPA的发生发展。
2023年06期 v.43;No.318 1263-1269+1296页 [查看摘要][在线阅读][下载 782K] [下载次数：163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：2 ] - 马孙婷;谭飞;王晓丽;马莉莉;徐彬;吕立新;冯志新;陈佩佩;欧阳伟;
为筛选鸡DEC-205的优势结合肽，以小鼠CD8α信号肽、鸡DEC-205具有结合作用的3个C型凝集素样结构域(CTLD-4、CTLD-5和CTLD-6)、人IgG1 Fc和His标签作为目的基因，设计构建重组表达质粒pcDNA3.1-DEC-205-Fc-his和pcDNA3.1-Fc-his(用于对照);转染293t细胞，Western blot鉴定蛋白表达；镍亲和层析法纯化蛋白，用于噬菌体线性12肽库筛选结合肽，protein G/A交替进行了3轮液相淘选，对第3轮噬斑提取DNA测序并统计肽重复率。对重复率较高的短肽进行合成，ELISA及荧光显微镜观察鉴定肽与重组蛋白的结合效果。Western blot结果显示，转染重组质粒的293t细胞裂解液和细胞上清均可表达目的蛋白，DEC-205-Fc-his蛋白约90 kDa, Fc-his蛋白约35 kDa,与预期大小符合，纯化的蛋白作为靶标进行3轮淘选后，15条序列出现重复，其中DLPVNSVIFPFR(DL)重复率最高(达到6.41%)。ELISA及荧光检测结果显示，合成的DL短肽可结合表达DEC-205-Fc-his的细胞，与表达Fc-his的细胞亲和性较低。筛选获得的DL短肽经体外鉴定，结果显示是鸡DEC-205的潜在配体，相关结果将为研发鸡DEC-205新型靶向策略奠定基础。
2023年06期 v.43;No.318 1270-1276页 [查看摘要][在线阅读][下载 371K] [下载次数：74 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 李成应;巩志国;张双翼;刘博;毛伟;
体外培养小鼠腹腔巨噬细胞后通过实时荧光定量PCR、Western blot、ELISA和流式细胞仪检测，分析模式识别受体TLR2和TLR4对脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导巨噬细胞前列腺素D合成酶表达和PGD_2分泌的影响。结果显示，在TLR2或TLR4缺失的情况下，LPS诱导巨噬细胞中H-PGDS和COX-2基因或蛋白的表达(P<0.05),以及PGD_2的分泌(P<0.01)会受到不同程度的影响。此外，分析了内外源性PGD_2对LPS诱导巨噬细胞TLR2和TLR4表达的影响。结果显示，前列腺素D合成酶抑制剂HQL-79和H-PGDS inhibitorⅠ预处理可显著下调LPS诱导TLR2的表达(P<0.001)。但是，当使用外源性PGD_2后，LPS诱导巨噬细胞TLR4的表达水平发生显著下调，而不是TLR2(P<0.05)。结果表明，TLR2和TLR4参与LPS诱导巨噬细胞中PGD_2合成分泌，且内外源性PGD_2对LPS刺激巨噬细胞诱导TLR2和TLR4的表达具有不同调控作用。
2023年06期 v.43;No.318 1277-1283页 [查看摘要][在线阅读][下载 489K] [下载次数：157 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 张航瑜;武玲;段睿洁;徐昆龙;
通过CCK-8法检测蚯蚓提取物和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对RAW 264.7细胞活性的影响，用不同质量浓度的蚯蚓提取物预处理RAW 264.7细胞后用LPS刺激诱导炎症反应，利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的转录水平，通过Griess法检测一氧化碳(NO)生成，Western blot检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、p65、p-p65、iκBα、p-iκBα的蛋白表达。结果显示，当蚯蚓提取物≤4 mg/L时没有细胞毒性，1～4 mg/L蚯蚓提取物可减少炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生，提升抑炎因子IL-10的分泌，显著抑制炎症介质NO及相关合成酶iNOS蛋白，以及抑制NF-κB的活化。结过表明，蚯蚓提取物具有显著的抗炎症作用，揭示蚯蚓提取物可用于治疗及预防部分炎症性疾病。
2023年06期 v.43;No.318 1284-1289页 [查看摘要][在线阅读][下载 454K] [下载次数：215 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 罗万和;鞠牧洁;冷楠楠;吾买尔江·牙合甫;关鼎;周继萍;刘金环;韩俊成;
制备了一种可避免对胃肠道产生刺激并具有缓释作用的硫酸头孢喹肟纳米凝胶制剂，并评价其对大肠杆菌的抗菌活性。以2-羟丙基-β-环糊精、海藻酸钠和Ca~(2+)的浓度以及转速为变量，包封率(EE)和载药量(LC)为指标，筛选出最优配方，并对其外观性状、微观形态、Zeta电位、粒径和溶胀行为进行表征，同时采用微量肉汤稀释法测定其对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)并绘制杀菌曲线。结果显示，2-羟丙基-β-环糊精为30 g/L、海藻酸钠为30 g/L和Ca~(2+)为2 g/L,且转速为1 200 r/min时，为最优配方；其EE和LC分别为(81.8±1.3)%和(54.3±0.8)%;其外观性状为澄清透明色，表现为凝胶状；扫描电镜结果显示硫酸头孢喹肟被包裹于所形成的网络结构中；平均粒径为(179.75±3.72) nm, Zeta电位为(-25.1±1.56) mV;所制备制剂在胃酸中具有较高的稳定性，在肠液中迅速发生溶胀；市售硫酸头孢喹肟注射液、硫酸头孢喹肟原料药和硫酸头孢喹肟纳米凝胶对大肠杆菌ATCC 25922的MIC分别为0.06,0.12,0.06 mg/L,对牛源大肠杆菌分离株的MIC分别为0.12,0.25,0.06 mg/L;体外杀菌曲线显示，硫酸头孢喹肟纳米凝胶对牛源大肠杆菌分离株表现出明显的质量浓度依赖性。结果表明，所制备的硫酸头孢喹肟纳米凝胶不仅可避免药物对胃肠道刺激反应，还通过缓释作用增强其对大肠杆菌的抗菌活性，进而为治疗由大肠杆菌引起的腹泻等疾病提供科学依据。
2023年06期 v.43;No.318 1290-1296页 [查看摘要][在线阅读][下载 388K] [下载次数：240 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：3 ] - 曹佳;王令令;王飞;何欣;赵兴华;
选择醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)为载体，采用反溶剂共沉淀法制备厚朴酚(magnold, MAG)固体分散体，利用粉末X射线衍射(PXRD)、差示扫描量热法(DSC)、红外光谱分析(FT-IR)、扫描电镜(SEM)对固体分散体进行表征分析和稳定性考察，并对其累积溶出速率及肉鸡口服药代动力学进行研究。结果显示，MAG-SD 1∶9和MAG-SD 2∶8的PXRD谱图中无MAG晶体衍射峰，DSC中无MAG熔点峰，证实MAG以无定形态分散于载体中，形成了固体分散体。在FT-IR中，MAG在3 132 cm~(-1)处-OH伸缩振动峰消失，与HPMCAS-LF结构中-OCH_3(2 940 cm~(-1))形成了2 929 cm~(-1)的新峰，表明两者之间形成了分子间氢键。该固体分散体在40℃、75%RH条件下270 d内稳定性良好。MAG-SD 2∶8在240 min内累积溶出率高达100%。在24 h内，MAG-SD 2∶8的C_(max)和AUC_(0～24)分别为(5.07±0.73) mg/L和(35.27±4.80) mg/(L·h~(-1)),分别是MAG的1.76倍和1.89倍，t_(1/2)比MAG延长2.14倍。结果表明，制备的MAG-SD 2∶8稳定性良好，可显著提高厚朴酚的累积溶出速率和肉鸡的生物利用度。
2023年06期 v.43;No.318 1297-1303页 [查看摘要][在线阅读][下载 690K] [下载次数：216 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ]
- 朱盈名;朱桓奕;王迎平;冯旭东;赵自亮;刘佳;骆泽礼;刘霞;杨晓伟;赵光伟;
为研究养殖大鲵临床以皮肤溃烂和腹部肿胀为特征的致病原及其病理组织学特征，对患病大鲵不同组织脏器进行系统的细菌分离与鉴定，明晰优势分离菌并通过动物回归试验确定致病菌，进而通过K-B纸片法筛选敏感治疗药物用于临床，并通过组织切片和HE染色对自然感染病例的病理组织学特征进行观察。结果共分离到43株细菌，分属于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、厦门希瓦菌(Shewanella xiamenensis)、河流漫游球菌(Vagococcus fluvialis)和葡萄牙柠檬酸杆菌(Citrobacter portucalensis),分离率分别为27.9%,25.6%,14.0%,14.0%,9.3%,2.3%,2.3%,2.3%和2.3%;结合大鲵回归试验，确定弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和约氏不动杆菌的混合感染是导致大鲵发病的主要原因；药敏试验显示头孢类药物(头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松)对分离菌具有良好的抑菌效果；自然感染大鲵肝脏、肾脏、脾脏、肺脏出现以细胞坏死、变性以及炎性细胞浸润为主要特征的病理学变化，与细菌性感染病变一致。本试验结果可为大鲵临床疾病的诊疗提供技术参考。
2023年06期 v.43;No.318 1304-1309页 [查看摘要][在线阅读][下载 452K] [下载次数：582 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：2 ] - 陈琳方;刘梦林;雷林;刘国文;
利用原代奶牛肝细胞进行体外试验，首先用0.0,0.6,1.2,2.4 mmol/L非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids, NEFA)处理奶牛原代肝细胞，通过Western blot检测各组IL-11和凋亡关键蛋白cleaved Caspase-3的表达，qRT-PCR检测IL-11 mRNA表达。结果显示，在高NEFA刺激下，1.2,2.4 mmol/L NEFA可显著升高IL-11和cleaved Caspase-3蛋白的表达，同时显著上调IL-11 mRNA表达；然后，通过短发夹RNA(sh-RNA)沉默IL-11,并用1.2 mmol/L NEFA处理奶牛原代肝细胞，通过Western blot检测IL-11和cleaved Caspase-3蛋白表达，qRT-PCR检测IL-11 mRNA表达，结果显示沉默IL-11可显著抑制NEFA诱导的cleaved Caspase-3的表达升高。结果表明，IL-11可通过促进cleaved Caspase-3的表达介导高NEFA诱导的奶牛原代肝细胞凋亡。
2023年06期 v.43;No.318 1310-1314+1341页 [查看摘要][在线阅读][下载 397K] [下载次数：195 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 张伟;何雨欣;麻芯茹;吕鑫泉;李铭;李思瑶;杨威;徐闯;张冰冰;
为研究胞内Ca~(2+)对亚临床低钙血症奶牛外周血中性粒细胞糖异生作用的影响，用枸橼酸钠抗凝管采集奶牛尾静脉血液分离中性粒细胞；对中性粒细胞进行RNA测序及分析，利用qRT-PCR技术对其进行验证；通过流式细胞术检测胞内Ca~(2+)水平；Western blot技术检测钙池调控钙离子进入(store-operated calcium entry, SOCE)分子(ORAI1、ORAI2、ORAI3、STIM1、STIM2)的表达情况。添加SOCE激活剂Thapsigargin(TG)改变细胞内Ca~(2+)水平，探究Ca~(2+)水平对糖异生作用的影响。RNA测序结果分析发现，差异基因富集在Ca~(2+)信号通路和糖异生作用通路上，qRT-PCR结果显示亚临床低钙血症奶牛的糖异生作用(FBP1、PKM2、G-6-Pase、PFKFBF3、AKR1B1)与正常奶牛相比下降；流式细胞术结果显示，亚临床低钙血症奶牛胞内Ca~(2+)水平下降；Western blot结果显示，亚临床低钙血症奶牛SOCE分子表达下降。在TG处理后，胞内Ca~(2+)水平上升，糖异生作用显著上升。结果表明，中性粒细胞内Ca~(2+)水平影响糖异生作用。
2023年06期 v.43;No.318 1315-1320页 [查看摘要][在线阅读][下载 490K] [下载次数：97 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ]