- 李莎莎;马彩娜;杨金平;朱紫祥;
为阐明更多非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)未知基因的功能，深入探究ASFV的致病机制，为研制针对ASFV流行毒株的疫苗提供候选毒株。采用同源重组的方法构建E184L基因缺失的非洲猪瘟单基因缺失毒株，在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)中评价其复制特性，并在猪体内比较ASFVΔE184L与亲本毒株ASFV CN/GS/2018对猪的致病力以及在动物体内诱导免疫应答的差异。成功获得了E184L单基因缺失突变毒株ASFVΔE184L,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定，证实该毒株E184L基因被成功缺失。复制特性研究发现，E184L基因的缺失削弱了ASFV在PAMs中的复制能力。动物体内试验显示，ASFVΔE184L接种猪在观察期内死亡1头，其余全部存活，而ASFV WT接种猪全部死亡，说明E184L的缺失导致ASFV的毒力显著下降。此外，与亲本毒株相比，ASFVΔE184L可诱导机体ASFV特异性抗体的产生及抗病毒因子干扰素β(interferon-β,IFN-β)的分泌。E184L为ASFV毒力相关基因及免疫抑制相关基因，其基因缺失毒株在猪体内的致病力显著减弱并能诱导机体内更强的免疫应答。以上结果为ASFV未知基因功能及其致病机制的阐明提供了新的理论依据，更重要的是，为在候选疫苗基因组中进一步缺失E184L基因片段构建安全有效的双基因或多基因缺失候选疫苗株奠定了重要基础。
2023年12期 v.43;No.324 2403-2411页 [查看摘要][在线阅读][下载 2751K] [下载次数：268 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 左百姣;贺叶青;李庆豪;孙娟;金鑫;夏璐;魏战勇;
旨在研究猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)感染对仔猪免疫系统的影响。选取10头5日龄健康仔猪随机分为空白对照组和PDCoV感染组(n=5),PDCoV感染72 h后剖解仔猪，采集仔猪的胸腺、扁桃体、脾脏和淋巴结(颈浅淋巴结、腹股沟淋巴结、髂下淋巴结、下颌淋巴结和肠系膜淋巴结),4%(g/L)的多聚甲醛溶液固定，苏木精-伊红染色观察免疫系统病理变化，免疫组织化学检测病毒分布。苏木精-伊红染色结果显示，PDCoV感染仔猪后脾和淋巴结都出现了明显的病理损伤。脾小梁增生；红髓增多，红髓和白髓界线不清、分布铁黄素颗粒；白髓萎缩，脾小结减少，淋巴细胞减少。淋巴结局部组织出现毛细血管充血或轻微出血，皮质和髓质界线不清，淋巴小结体积增大，数量增多，生发中心明显变大。免疫组织化学结果显示，仔猪肠系膜淋巴结有大量病毒分布，下颌淋巴结存在少量病毒，其余免疫组织无病毒分布。上述结果说明，PDCoV感染后可引起仔猪免疫器官产生病理损伤，降低仔猪的免疫功能，这为深入了解PDCoV致病机制和临床防控提供了理论依据。
2023年12期 v.43;No.324 2412-2417页 [查看摘要][在线阅读][下载 3520K] [下载次数：363 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 庞忠宝;黄颖;冯春燕;翟文竹;吉日木图;朱鸿飞;贾红;
探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides, CpG ODN)和ICTYOLANE~(TM)31微乳佐剂对重组表达的ASFV-CD2v蛋白在小鼠体内免疫效果的影响。以杆状病毒表达的CD2v蛋白为抗原，分别配伍CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide, CPG ODN)和ICTYOLANE~(TM)31微乳佐剂，皮下免疫BALB/c小鼠。首次免疫后14 d进行二免，采集首免后0、14 d以及二免后7、14及28 d血清，通过间接ELISA检测血清中CD2v抗体水平；采集二免后35 d小鼠分离脾脏淋巴细胞，通过流式细胞术分析IFN-γ水平。结果显示，间接ELISA结果显示在二免后7 d可检测到较高水平的CD2v抗体，ICTYOLANE~(TM)31佐剂和CPG ODN佐剂组抗体水平明显高于蛋白组。T细胞亚群分析结果显示，在二免后35 d, CpG ODN佐剂组的CD4~+T淋巴细胞的比例最高，达到81.34%,ICTYOLANE~(TM)31佐剂组CD8~+T淋巴细胞的比例最低，仅为11.37%。ICTYOLANE~(TM)31佐剂组CD4~+/CD8~+比值最高，ICTYOLANE~(TM)31佐剂组CD4~+ T细胞IFN-γ分泌水平最高，可达9.07%,但CpG ODN佐剂组、ICTYOLANE~(TM)31佐剂组及蛋白组间差异不显著。推断，小鼠在第二次免疫后7 d产生了较高水平的抗体，CpG ODN、ICTYOLANE~(TM)31佐剂对ASFV-CD2v蛋白均可增强免疫小鼠产生CD2v抗体的水平，其中CpG ODN佐剂作用更强。ICTYOLANE~(TM)31佐剂及CpG ODN佐剂可以增强机体细胞免疫，其中ICTYOLANE~(TM)31佐剂作用更强。该研究为非洲猪瘟亚单位疫苗相关佐剂的筛选提供了一定参考。
2023年12期 v.43;No.324 2418-2424页 [查看摘要][在线阅读][下载 2094K] [下载次数：171 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 彭莉;张焕东;李忠斐;肖鹏;颜焰;董伟仁;周继勇;廖敏;
为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位，本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠，经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为10~6以上，Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株，同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测，发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后，在抗原表位和Western blot分析的基础上，鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域，获得了6个中和抗原表位，其中除~(416)IQTRTEP~(422)表位，其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体，不仅丰富了IBV的单克隆抗体库，为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料；获得的6个S1蛋白中和抗原表位也为后续建立IBV疫苗免疫效果评价方法和亚单位疫苗开发提供了工具。
2023年12期 v.43;No.324 2425-2432页 [查看摘要][在线阅读][下载 1874K] [下载次数：707 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：2 ] - 董帅;杨哲;孟卫芹;陈金龙;刘建钗;沈志强;王金良;
为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)Ⅱ系与Ⅳ系毒株SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR的鉴别检测方法，针对PPRV-H基因的高变区域设计1对特异性引物，确定反应条件，分析其敏感性和特异性，并对临床样本进行验证。60℃退火、76℃收集荧光信号获得试验效果最好，熔解曲线为单一峰，Ⅱ系毒株熔解温度78.63℃,Ⅳ系毒株熔解温度80.08℃,易于区分；最低检测限为10拷贝/μL,批内、批间变异系数均小于0.5%,羊口疮病毒(ORFV)等4种病毒无扩增曲线产生；检测140份临床样本，与国家标准检测方法结果符合率100%。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR检测方法可以快速、灵敏和特异地鉴别检测出PPRVⅡ系与Ⅳ系毒株，满足疫病快速诊断的需求。
2023年12期 v.43;No.324 2433-2438页 [查看摘要][在线阅读][下载 1806K] [下载次数：217 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 王翱飞;滕志东;罗新;柳海云;董虎;白满元;孙世琪;郭慧琛;张小丽;
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是一种高度传染性疾病，严重影响着畜牧业的发展。近年来，病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)疫苗因具有安全、高效等优点，成为当前FMD疫苗研究热点。为解决FMDV VLPs疫苗免疫原性弱的问题，本研究选取CpG、GM-CSF和FliB佐剂，与ISA206联合后分别与FMDV VLPs配伍，免疫豚鼠后通过检测豚鼠特异性抗体、中和抗体、脾淋巴细胞增殖能力及FMDV的攻毒保护率，探究其对FMDV VLPs疫苗的免疫增强效果。结果表明，CpG与ISA206联合作为佐剂可有效地刺激机体产生更高水平的特异性抗体和中和抗体，同时能够提高动物的攻毒保护率，从而增强了FMDV VLPs疫苗的免疫效力，研究结果为FMDV VLPs疫苗及其他蛋白质类疫苗最优佐剂的选择提供了依据。
2023年12期 v.43;No.324 2439-2444页 [查看摘要][在线阅读][下载 1585K] [下载次数：429 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：5 ] - 闫曼平;商金源;叶京飞;罗国良;王振军;易立;冯二凯;王春霞;赵宗正;陈明军;魏先力;高华;单晓枫;程悦宁;
为建立检测水貂犬瘟热病毒(mink canine distemper virus, CDV)的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量方法，以便提供水貂CDV在诊断检测方面的技术支持，本研究根据实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法原理，建立了水貂CDV数字PCR方法，并优化了反应条件，评估了特异性、敏感性以及重复性。结果表明：ddPCR方法检测CDV的最适引物浓度为900 nmol/L,探针浓度为250 nmol/L,退火温度为55℃,升降温度为2.5℃/s,最低检测下限为4.4拷贝/μL;除CDV特异性扩增，其他常见病毒特异性检测结果均为阴性；重复性试验的变异系数均小于5%。采用该微滴数字PCR和荧光定量RT-PCR方法对30份犬、貂、狐、貉等组织(其中CDV阳性样品7份)样品进行检测，检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的微滴数字PCR方法对CDV定量检测特异性强、灵敏度高，重复性好，可以用于水貂CDV临床样品的核酸检测，对水貂CDV发病早期的诊断提供新的定量检测方法。
2023年12期 v.43;No.324 2445-2450页 [查看摘要][在线阅读][下载 1677K] [下载次数：299 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 李欣;李伊铭;赵洪哲;王亚新;王凤雪;温永俊;
牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起牛发热、腹泻、黏膜糜烂溃疡等症状，给养牛业带来严重经济损失，新型疫苗的研发意义重大。狂犬病病毒(rabies virus, RV)作为病毒载体可稳定表达外源蛋白，反过来外源蛋白也不会阻碍病毒的复制。本研究目的是利用反向遗传操作技术构建和拯救表达BVDV结构蛋白的重组RV,以期获得一种能表达高水平BVDV E2蛋白的重组病毒。选择Ⅰ型BVDV主要优势抗原E2蛋白基因序列进行优化后合成E2基因片段，利用Overlap PCR的方法将E2基因改造为DE2片段，以RV疫苗毒株LBNSE为病毒载体，利用BsiWⅠ和NheⅠ酶切位点，将DE2基因插入LBNSE基因组中，成功构建pRV-DE2重组质粒。脂质体法将全长重组质粒转染BSR细胞后，拯救重组病毒RV-DE2,并用直接免疫荧光和RT-PCR的方法对其鉴定，对构建成功的病毒进行生长特性、致病性、重组蛋白表达特性等生物学特性和小鼠体内免疫效力的研究。结果表明，RV-DE2病毒滴度在F3代之后趋于稳定，在相同的培养条件下比亲本LBNSE病毒滴度高。重组病毒对小鼠无致死性，E2蛋白表达量高于BVDV。将灭活的重组病毒免疫小鼠后成功产生了抗BVDV的中和抗体。表达BVDV E2的重组RV的成功拯救为BVDV新型疫苗的研发提供候选毒株，对BVD的防控提供了一种新的思路。
2023年12期 v.43;No.324 2451-2456页 [查看摘要][在线阅读][下载 1558K] [下载次数：259 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 刘鑫欢;何苗锋;张纹纹;程子龙;毛立;杨蕾蕾;刘茂军;白娟;李文良;
为了建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白抗体的阻断ELISA方法，以BVDV-1重组E2蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的BVDV-1 E2蛋白的单克隆抗体作为检测抗体，经过一系列的条件筛选与优化，建立阻断ELISA方法，并对该检测方法的特异性、敏感性和与中和试验结果的符合率进行测定。经优化后的最佳反应条件：抗原包被质量浓度为0.25 mg/L;酶标单抗稀释度为1∶2 000,37℃孵育1 h;待检血清稀释度为1∶8,37℃孵育1.5 h; 37℃避光显色10 min。使用该方法对87份BVDV阴性牛血清进行检测，确定当待检血清的阻断率≤21.13%时，该血清为阴性；阻断率≥26.86%时，该血清为阳性。该方法检测BVDV-2、边界病病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型、口蹄疫病毒、布鲁菌、副结核及牛支原体阳性血清均无交叉反应；最低可检出中和效价为8的阳性血清。用该方法检测105份临床血清样品，与血清中和试验总符合率为93.33%,且阻断率与中和抗体效价呈正相关。上述结果表明，本研究建立的阻断ELISA方法特异性好、灵敏度高、操作简便，为BVDV流行病学调查及免疫效果评估提供了一种新的技术手段。
2023年12期 v.43;No.324 2457-2462页 [查看摘要][在线阅读][下载 1371K] [下载次数：556 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：2 ] - 陈世雄;段世宇;张家莉;杨婉;杨琦;
为探究沙门菌Ⅲ型分泌系统(STM T3SS)相关基因缺失株的部分生物学特性及致病力，本试验利用λ-Red同源重组技术构建T3SS相关基因缺失株LT2 ΔprgI::scar、LT2 ΔprgJ::scar、LT2 ΔprgH::scar、LT2 ΔprgK::scar、LT2 ΔinvG::scar、LT2 ΔinvC::scar和LT2 ΔspaP::scar,以鼠伤寒沙门菌野生型(STM LT2)作为对照，通过生长曲线测定、遗传稳定性试验、生物被膜形成能力检测、细菌定植试验、细菌泳动性测定和动物致病性试验分析两者间的区别，结果显示：T3SS相关基因缺失株生长性变化不大，能够稳定遗传，但其定植能力、运动能力有不同程度的减弱；对于缺失株LT2 ΔinvC::scar、LT2 ΔprgH::scar、LT2 ΔprgJ::scar和LT2 ΔprgK::scar的成膜能力虽有小幅降低，但仍有较强的成膜能力，其余菌株在缺失后，成膜能力显著降低；LD50测定结果显示，相对于STM LT2,缺失株半数致死量LD_(50)数值均出现上升趋势，分别上升了2.57、4.07、406.76、161.89、89.75、89.75和64.45倍，证明缺失株毒力发生明显下降。以上结果为研究T3SS相关基因的生物学功能及沙门菌的致病性提供了理论基础，为鼠伤寒减毒疫苗研制与新型抗菌药物研发提供了新的思路。
2023年12期 v.43;No.324 2463-2471页 [查看摘要][在线阅读][下载 2051K] [下载次数：404 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 何忆箫;秦豆豆;彭兰青;程中林;高继业;李继祥;
旨在筛选和鉴定与鸭补体调节因子Vitronectin(Vn)结合的鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,R.anatipestifer)外膜蛋白。在酵母表达鸭Vn及间接免疫荧光和免疫斑点杂交试验检测鸭疫里默杆菌结合Vn的基础上，以重组Vn为诱饵蛋白进行His pull-down及LC-MS/MS质谱鉴定，筛选外膜蛋白并进行生物信息学分析；原核表达候选外膜蛋白及截短片段，制备多克隆抗体，利用Far-Western blot验证与鸭Vn结合，并用间接ELISA测定肝素和氯化钠对结合的影响；测定Vn及抗外膜蛋白抗体对血清杀菌活性的影响。结果显示，鸭疫里默杆菌能在体外结合鸭Vn,经His-pull down、质谱鉴定及蛋白质结构分析，筛选出的外膜蛋白Omp45具有β桶状结构及7个暴露于细胞膜外的多肽环；成功原核表达Omp45及截短片段，制备的抗Omp45多克隆抗体间接ELISA效价超过1∶12 800,Western blot检测多克隆抗体可以与重组蛋白发生特异性反应；Far-Western blot及间接ELISA结果显示，Omp45、包含2个及以上细胞膜外多肽环的截短片段同时以肝素和氯化钠敏感方式结合Vn;血清杀菌试验结果显示，鸭疫里默杆菌对缺乏Vn的健康鸭血清的抵抗力降低，在抑制补体经典激活途径条件下抗Omp45抗体也能极显著降低细菌在鸭血清中的存活率(P<0.01)。结果表明，成功筛选并鉴定了与鸭Vn结合的鸭疫里默杆菌外膜蛋白Omp45,为进一步阐明鸭疫里默杆菌致病机制奠定了基础。
2023年12期 v.43;No.324 2472-2479页 [查看摘要][在线阅读][下载 1852K] [下载次数：130 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 崔苗苗;陈凯楠;李金斗;丁佳欣;陈铭桦;冯嘉轩;周铁忠;舒秀伟;刘晓雷;丁壮;
信使RNA(messenger RNA,mRNA)的核酸疫苗是近年来兴起的一种新型疫苗技术。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)是NDV的主要保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，是新城疫(Newcastle disease, ND)新型疫苗研发的重要靶点。本研究将NDV HN基因连接到含有T7启动子的载体中，并在其5′UTR和3′UTR分别引入人-β球蛋白的非编码区域以增强转录的mRNA稳定性，经质粒线性化、体外转录、cap加帽处理、mRNA纯化制备NDV HN-mRNA,将其转染至HEK-293T细胞中验证NDV HN-mRNA的表达效果，Western blot和免疫荧光试验结果表明构建mRNA候选疫苗可在HEK-293T细胞中高效表达抗原蛋白，为ND新型疫苗的研发提供新的思路。
2023年12期 v.43;No.324 2480-2485页 [查看摘要][在线阅读][下载 1457K] [下载次数：412 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 丁立;张力;刘全;
蜱传病呈全球分布，危害人类和动物健康。为了研究湖南省娄底市现存蜱媒病原体，于2021—2022年在湖南省娄底市采集1 395只微小牛蜱样本，提取蜱样品基因组DNA。选取蜱线粒体COI基因扩增特异性的基因片段，对微小牛蜱进行鉴定。为了对该蜱携带的病原进行检测，采用PCR方法对立克次体ompA和gltA基因，无形体groEL和23S rRNA基因，埃立克体groEL和16S rRNA基因，螺旋体16S rRNA和23S rRNA基因进行扩增，对阳性产物进行克隆测序，测序获得的基因序列进行系统发育分析来确定病原的基因型。结果显示，从蜱样本中检测出5种蜱传细菌病原，包括敬信立克次体(Candidatus Rickettsia jingxinensis)、中央无形体(Anaplasma centrale)、扁平无形体(Anaplasma platys)、米氏埃立克体(Ehrlichia minasensis)和宫本疏螺旋体(Borrelia miyamotoi)。其中敬信立克次体、米氏埃立克体和宫本疏螺旋体阳性率均为2.16%,扁平无形体阳性率为0.30%,中央无形体阳性率为5.79%。本研究利用物种鉴定与分子生物学相结合的方法，从分子流行病学角度解析这些病原体在蜱体内存在及流行情况，并且在湖南省蜱中检测到扁平无形体和宫本疏螺旋体两种人兽共患病原体，可为湖南省的虫媒疾病的研究和防控提供数据参考。
2023年12期 v.43;No.324 2486-2494页 [查看摘要][在线阅读][下载 2607K] [下载次数：290 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：5 ] - 葛晓敏;李才善;缪荣浩;郑会珍;温丽翠;郭庆勇;
旨在克隆、表达环形泰勒虫HSP90基因并筛选与其结合的中药单体。对新疆地方环形泰勒虫株HSP90基因进行PCR扩增、克隆测序，并构建系统进化树。对HSP90蛋白理化特性、高级结构与亚细胞定位进行预测分析。构建原核表达载体HSP90-pET32a,筛选诱导表达条件，经镍株纯化重组蛋白并用Western blot检测其免疫原性。使用DrugRep服务器对靶向环形泰勒虫HSP90的中药单体筛选。结果显示，HSP90基因编码的蛋白序列与小泰勒虫序列(登录号：XP 766455)同源性较高。HSP90蛋白编码223个氨基酸，理论pI为8.4,具有28个磷酸化位点。HSP90蛋白二级结构以α-螺旋(66.37%)和无规则卷曲(19.28%)为主，存在多个B细胞抗原表位，亚细胞定位主要分布于细胞质。HSP90-pET32a蛋白相对分子质量约50 ku, 0.2 mmol/L IPTG诱导3 h蛋白表达较好。Western blot结果显示，该蛋白具有较好的免疫原性。经虚拟筛选，发现了5种与环形泰勒虫HSP90有较好结合力中药单体，其中圣草次甙结合力最强(affinity=-8.5 kJ/mol),作用方式以氢键和疏水作用为主。该数据为研发抗环形泰勒虫疫苗、诊断方法和初步筛选治疗环形泰勒虫病的中药提供理论依据。
2023年12期 v.43;No.324 2495-2501页 [查看摘要][在线阅读][下载 1769K] [下载次数：94 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ]
- 鲍佳鹏;孙悦;张建军;苏岳乐;毕力格;郭宇;巴依尔塔;赵东辉;陈彪;冯紫佳;郑可;秦建华;
为了改善ESAT6-CFP10融合蛋白检测牛结核分枝杆菌感染存在灵敏度低的问题，应用铁蛋白骨架显著性提升EC(ESAT6-CFP10)法的灵敏度，将ESAT6、CFP10和牛源铁蛋白重链(BFH)用柔性多肽连接，按照ESAT6-CFP10-BFH的串联组合方案设计基因序列，构建pET-28a-EC-BFH重组质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。使用自诱导培养基对铁蛋白EC融合抗原(EC-BFH蛋白)进行诱导表达，亲和层析镍柱法纯化EC-BFH蛋白，使用蛋白印迹(Western blot)对EC-BFH蛋白进行鉴定及纯度测定。将EC-BFH蛋白对健康豚鼠进行皮试，通过观察皮试部位是否会引起炎性反应，验证EC-BFH蛋白的特异性。对牛结核分枝杆菌致敏成功的豚鼠，以提纯牛型结核菌素(PPDB)作为对照，检测EC蛋白和EC-BFH蛋白效价对比阳性率。结果表明：EC-BFH蛋白的相对分子质量约为48.4 kDa,与预期相同，说明成功纯化EC-BFH蛋白。EC-BFH蛋白对健康豚鼠进行皮试24 h后无炎症反应，说明EC-BFH蛋白特异性良好。根据阳性率数据显示EC-BFH蛋白效价远远高于EC蛋白；在注射量为1,10和20μg时，EC-BFH蛋白皮试的阳性率均高于EC蛋白，尤其注射量在1μg时，EC蛋白和EC-BFH蛋白的阳性率分别为16.6%和100%,且EC-BFH蛋白与PPDB的阳性率接近。结果表明EC-BFH融合蛋白提高了EC法检测牛结核分枝杆菌感染的灵敏度，增强了皮试反应效果，作为检测牛结核分枝杆菌感染的诊断试剂有很大的研究价值。
2023年12期 v.43;No.324 2502-2508页 [查看摘要][在线阅读][下载 1502K] [下载次数：219 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：5 ] - 蒋俊明;刘志勇;程逸文;吴慧;潘浩举;陈巧玲;高宏岩;满初日嘎;陈思;王凤阳;杜丽;
为了探究RSAD2在羊口疮病毒(Orf virus, ORFV)感染下的作用机制，本研究通过慢病毒系统构建RSAD2表达下调的山羊皮肤成纤维(goat skin fibroblast, GSF)细胞。在ORFV感染0、6 h时，分别对GSF细胞(空白对照组：C0、C6)、转染含无意义shRNA慢病毒载体的GSF细胞(阴性对照组：N0、N6)以及RSAD2表达下调的GSF细胞(试验组：R0、R6)进行转录组测序，分析RSAD2影响GSF细胞的免疫应答反应。结果表明，R6 vs R0有1 154个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)并显著富集到NOD样受体信号通路和Toll样受体信号通路。RT-qPCR验证了8个DEGs的表达，包括ACKR3、IL-1A、CCL20、SDC4、SESN2、PCK2、GADD45A和MKNK2。另外，IL-6在ORFV感染及RSAD2干扰后，表达均呈下降的趋势。在蛋白质互作网络中，IL-6蛋白被鉴定潜在的核心蛋白之一，提示其可能与RSAD2蛋白协同抵抗ORFV感染。本研究阐述了RSAD2表达下调GSF细胞在ORFV感染条件下的免疫图谱，为后续RSAD2抗ORFV机制及宿主-ORFV相互作用研究奠定了基础。
2023年12期 v.43;No.324 2509-2519页 [查看摘要][在线阅读][下载 2427K] [下载次数：229 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 仝晓丹;王同燕;王玉娟;李园园;张盼涛;刘武杰;薛景景;胡小飞;谭菲菲;田克恭;
为拯救具有高复制特性的G1-like型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)疫苗候选株，利用反向遗传操作技术，将高复制特性H9N2亚型CZ株(Y280-Like)的6个内部基因(PB2、PB1、PA、M、NP、NS)与H9N2亚型40926株(G1-like)的HA和NA基因进行重配，构建G1-like型重组病毒。通过HA、HI试验及基因测序对拯救病毒进行鉴定，并对病毒在鸡胚上的复制能力、遗传稳定性及免疫原性进行评价。结果表明，利用6+2质粒系统成功拯救出G1-Like型H9N2亚型重组流感病毒，并具有良好的复制特性和遗传稳定性；将拯救的重组病毒株灭活后免疫SPF鸡，能刺激产生较高的HI抗体，为防控G1-like型AIV流行提供了技术和疫苗候选株储备。
2023年12期 v.43;No.324 2520-2524页 [查看摘要][在线阅读][下载 1352K] [下载次数：239 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 王浩然;赵建梅;刘娜;左秀丽;王娟;王琳;张喜悦;王君玮;曲志娜;李存;
为了解不同地区猪鸡源沙门菌的流行分布和耐药特征，采用PCR法、药敏纸片法、微量肉汤稀释法及Bionumerics和SPSS软件等，对来自我国安徽、浙江、山东、新疆、江苏5省区的沙门菌进行血清型鉴定、ESBLs表型和基因型检测、药物敏感性试验以及数据处理。结果显示，85株沙门菌共鉴定出15种血清型；分离出25株(29.4%)产ESBLs菌株，猪源产超广谱β内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactam, ESBLs)沙门菌检出率(4.7%)远低于鸡源(54.8%)(P<0.01);产ESBLs沙门菌对7种抗菌药的耐药率显著高于非产ESBLs的菌株(P<0.01);85株沙门菌中基因型检测结果为：TEM型44.7%(38/85),CTX-M型12.9%(11/85),OXA型10.6%(9/85),SHV型9.4%(8/85),有基因型共存现象；产ESBLs沙门菌中有19株携带4种耐药基因，相关性达到76%;各省分离菌株对氨苄西林、庆大霉素、大观霉素、头孢噻呋、四环素、头孢他啶的耐药率有极显著差异(P<0.01),对恩诺沙星的耐药率有显著差异(P<0.05),江苏分离菌株耐药率最低，新疆分离菌株耐药率最高；85株沙门菌共分为19个ST型，猪源沙门菌的优势序列型为ST34、ST155、ST469,鸡源为ST11、ST34、ST198。结果显示：产ESBLs沙门菌在鸡场广泛存在，其表型和基因型检测结果有高相关性，对多种抗菌药普遍耐药；鸡源沙门菌较猪源耐药严重；不同省区耐药率也有较大差异，江苏菌株耐药率为5省中最低；5省区血清型、ST型差异较大，不同ST型菌株有较为固定的血清型。提示应根据不同动物源、地区的具体情况指导实际生产，因地制宜，对症下药，预防和减少耐药性的产生。
2023年12期 v.43;No.324 2525-2533页 [查看摘要][在线阅读][下载 1718K] [下载次数：242 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：6 ] - 路洋;张捷;蔡萍;沈祥广;蒋红霞;徐晓立;
2020年8月从广东省某大型养鸡场不同区域采集粪便、土壤、水体等样品共654份，进行替加环素耐药大肠杆菌的分离鉴定；PCR方法检测替加环素耐药大肠杆菌的tet(X4)基因；PFGE分型检测tet(X4)阳性大肠杆菌的克隆传播情况；采用琼脂二倍稀释法和肉汤二倍稀释法测定tet(X4)阳性大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC);接合转移试验检测tet(X4)水平传播情况。结果显示，共分离得到204株替加环素耐药大肠杆菌，检测出165株tet(X4)阳性大肠杆菌，检出率为25.23%(165/654)。根据菌株来源和分离率，挑选72株进一步研究tet(X4)阳性大肠杆菌在该养鸡场的流行特征。PFGE分型将72株tet(X4)阳性大肠杆菌分为39个簇，表明该养鸡场无明显克隆传播现象。tet(X4)阳性大肠杆菌对替加环素的MIC范围为8～16 mg/L,且表现多重耐药表型，对四环素、多西环素、米诺环素、氨苄西林、氟苯尼考均表现高水平耐药，而对黏菌素、美罗培南均敏感。接合转移试验表明，tet(X4)阳性大肠杆菌主要位于IncHI1型质粒上(93.06%)。结果表明，tet(X4)基因在该养殖场主要随IncHI1质粒传播，提示应加强养殖场大肠杆菌tet(X4)的监测。
2023年12期 v.43;No.324 2534-2539页 [查看摘要][在线阅读][下载 1671K] [下载次数：230 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：1 ] - 周可心;谢梦琪;赖加翠;杨玉姣;丁红雷;
α-淀粉酶是一种广泛存在的淀粉分解酶，催化淀粉和相关α-葡聚糖中α-1,4-葡萄糖苷键的水解，它可以定位在不同细菌的不同位置。大肠杆菌O157:H7 Z3955基因的同源基因在非致病性大肠杆菌编码α-淀粉酶，可以确定Z33955蛋白的准确定位。PCR扩增大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株的Z3955基因，扩增的基因片段连接pGEX-6P-1载体构建重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，表达重组蛋白GST-Z3955,并用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化。纯化的GST-Z3955免疫BALB/c小鼠产生抗血清。利用GST-Z3955蛋白的抗血清检测Z3955在细菌中的亚细胞定位。最终成功构建了能表达目的蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)-pGEX-6P-1-Z3955重组菌。用纯化的重组GST-Z3955蛋白免疫小鼠，获得了Z3955多克隆抗体。免疫印迹确定Z3955抗血清的最佳工作浓度为1∶12 500。Z3955定位在大肠杆菌O157:H7的胞质、内膜、细胞周质和外膜，但不能分泌到细胞外。Z3955蛋白的亚细胞定位鉴定将有助于该蛋白的功能研究，并有助于了解Z3955在大肠杆菌O157:H7发病机制中的作用。
2023年12期 v.43;No.324 2540-2545页 [查看摘要][在线阅读][下载 1481K] [下载次数：224 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ]
- 常仁旭;杨青;孙旭东;徐闯;
旨在探究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子kappaB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)通路在β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate, BHBA)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的分子作用机制。通过添加不同浓度的BHBA诱导奶牛乳腺上皮细胞MAC-T以模拟奶牛高酮血症中乳腺上皮细胞的炎性反应，并利用RNAi技术将TLR4-siRNA转染细胞42 h后加入3.6 mmol/L BHBA再处理24 h;通过RT-qPCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)和IL-6等炎性因子的表达变化，并采用Western blot法测定TLR4/NF-κB通路关键蛋白的相对表达水平。结果表明，与对照组相比，不同浓度BHBA处理后，乳腺上皮细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高，当BHBA浓度为1.2 mmol/L或以上时，p-NF-κB p65/NF-κB p65比值和TRAF6蛋白水平显著升高，浓度为2.4 mmol/L或以上时，TLR4和MyD88蛋白表达量显著升高。此外，与Control siRNA+BHBA组相比，TLR4 siRNA+BHBA组的MAC-T细胞中的TLR4、MyD88和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平显著降低，TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达水平显著降低。以上结果表明，BHBA可通过激活TLR4/NF-κB信号通路促进炎症因子的转录，诱导乳腺上皮细胞的炎性反应，下调TLR4可减轻BHBA诱导的乳腺上皮细胞炎性损伤。
2023年12期 v.43;No.324 2546-2553页 [查看摘要][在线阅读][下载 1971K] [下载次数：324 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 陈梦佳;李思佳;闫茜;王燕新;陈莫斯楠;石德顺;陆凤花;
旨在探究甜菜碱对猪胎儿成纤维细胞(PFFs)m6A甲基化修饰的影响，以期揭示甜菜碱与PFFs RNA表观遗传修饰的关系。取适宜体长的胎猪分离PFFs,添加不同浓度甜菜碱培养PFFs不同时间，利用CCK-8检测细胞增殖活性；并通过免疫荧光染色法检测细胞整体m6A甲基化修饰水平；采用qRT-PCR检测细胞凋亡相关基因(Bcl, Bax)、m6A甲基转移酶基因(METTL3,METTL14,WYAP)、去甲基酶基因(ALKBH5,FTO)和阅读蛋白(YTHDC1,YTHDF1,YTHDF2)的表达情况。结果表明，添加20,50 mmol/L甜菜碱对细胞凋亡和增殖活性影响最小，高于100 mmol/L甜菜碱可抑制细胞增殖。免疫荧光染色结果显示，甜菜碱可显著提高PFFs中m6A修饰整体水平(P<0.05),且以剂量依赖模式增加m6A水平。qRT-PCR结果显示，20 mmol/L甜菜碱可抑制细胞凋亡，且显著改变m6A修饰酶基因的表达水平(P<0.05)。综上所述，甜菜碱通过改变m6A相关酶的表达，从而有效提升PFFs m6A甲基化修饰水平，为进一步挖掘RNA表观遗传修饰与体细胞克隆供体细胞重编程的关系提供理论依据。
2023年12期 v.43;No.324 2554-2560页 [查看摘要][在线阅读][下载 1751K] [下载次数：283 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 王旋;李卓;孙旭东;徐闯;
旨在探讨游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)是否通过核转录因子E2相关因子2(nuclear factor E2-reated factor 2,NFE2L2)信号通路诱导肉牛单核巨噬细胞的氧化应激。采牛颈静脉血，体外分离培养肉牛单核巨噬细胞，用不同浓度的FFA(0、0.3、0.6和1.2 mmol/L)处理肉牛单核巨噬细胞24 h;用10μmol/L的萝卜硫素(sulforaphane, SFN)预处理细胞24 h后加入1.2 mmol/L FFA再处理24 h。使用各类试剂盒分别检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)和脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的活性；通过q-PCR对Caspase-3、Caspase-9、NFE2L2及其下游血红素加氧酶1(heme oxyenase-1,HMOX1)和醌氧化还原酶(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)的基因表达水平进行定量分析；使用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果显示，与对照组相比，不同浓度FFA处理细胞后，ROS和MDA的含量呈浓度依赖性升高(P<0.05),SOD和GSH-Px的活性逐渐下降(P<0.05);Caspase-3和Caspase-9基因相对表达量增加，细胞凋亡率显著增加；NFE2L2、HMOX1和NQO1的mRNA水平显著降低。与FFA+DMSO组相比，FFA+SFN组的NFE2L2 mRNA表达量显著升高(P<0.05),HMOX1、NQO1的mRNA表达水平显著升高(P<0.05);ROS和MDA的含量显著降低(P<0.05),SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。与FFA+DMSO组相比，FFA+SFN组细胞凋亡率显著降低。结果表明，SFN通过激活NFE2L2信号通路缓解FFA诱导的肉牛单核巨噬细胞氧化应激和凋亡。本研究为探明高FFA导致的肉牛单核巨噬细胞氧化损伤和凋亡的治疗靶点提供了理论依据。
2023年12期 v.43;No.324 2561-2568页 [查看摘要][在线阅读][下载 1714K] [下载次数：166 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ]
- 王梦媛;孙宇;孟令帅;李世杰;马兴红;
为探究10种血清型腺相关病毒(AVV)在哺乳动物子宫原代细胞中的转导情况并筛选出转导效率高的血清型，通过酶消化法获取哺乳动物子宫上皮和基质细胞、Real-Time PCR测定病毒滴度以及荧光显微镜观察和Western blot技术探究其转导效率。结果显示，10种血清型在小鼠子宫上皮细胞中，AAV-DJ可转导；在小鼠子宫基质细胞中的转导效率为AAV-DJ>AAV1、AAV2、AAV5>AAV9。在兔子宫上皮细胞中的转导效率为AAV5、AAV-DJ>AAV2>AAV9;在兔子宫基质细胞中的转导效率为AAV-DJ>AAV1、AAV2、AAV5>AAV9。在猪子宫上皮和基质细胞中的转导效率为AAV-DJ>AAV2、AAV5>AAV1。在人子宫基质细胞系中的转导效率为AAV-DJ>AAV2、AAV9>AAV1、AAV3>AAV8。综上所述，在转导哺乳动物子宫上皮细胞时，AAV-DJ、AAV5和AAV2效果较好；在转导哺乳动物子宫基质细胞时，AAV-DJ、AAV2、AAV9、AAV5、AAV1效果较好。
2023年12期 v.43;No.324 2569-2575页 [查看摘要][在线阅读][下载 1881K] [下载次数：160 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：5 ] - 袁婷婷;徐海翔;徐琨;何西建;宋学雄;
旨在探索过表达Fad24基因对猪DFAT细胞诱导成脂分化的影响。根据猪Fad24基因序列设计引物，克隆猪Fad24基因的全长CDS区片段，构建猪Fad24过表达载体，通过测序比对碱基和氨基酸序列，通过脂质体瞬时转染技术，将过表达Fad24载体转染猪DFAT细胞，从mRNA水平验证了Fad24基因在猪DFAT细胞中的过表达水平，然后将过表达Fad24的猪DFAT细胞在体外诱导成脂分化，从形态学、Fad24、成脂和成骨分化核心转录因子表达水平上进行了检测。结果表明，猪Fad24过表达载体碱基序列一致性高达99.8%,氨基酸序列一致性高达100%;过表达Fad24的猪DFAT细胞Fad24的表达量高出正常猪DFAT细胞表达量约45倍；成脂分化诱导5 d时，与对照组的正常分化比较，过表达Fad24的猪DFAT细胞成脂分化完全被抑制，相反强力转向成骨分化，细胞积聚成许多小结节，诱导7 d时已形成典型的成骨样大结节，表面可见细胞分泌物；经茜素红染色鉴定，证实细胞分泌物中含有矿化物质沉淀；经Real-time PCR检测，证实过表达Fad24试验组显著下调成脂分化核心转录因子PPARγ2、SREBP-1c(P<0.05)和显著上调成骨分化核心转录因子Runx2的表达(P<0.01)。结果提示，过表达Fad24通过调控成脂和成骨核心转录因子，完全抑制猪DFAT细胞成脂分化，并强力促进向成骨分化转化。
2023年12期 v.43;No.324 2576-2582页 [查看摘要][在线阅读][下载 1602K] [下载次数：69 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 李欣妤;徐在品;洪晗;王瑶;李胤霆;李灿欣;杨芸芸;
通过使用球囊损伤联合高脂饲料喂养的方法建立犬颈总动脉粥样硬化致狭窄模型，并探讨介入治疗机制。选取1周岁雌性比格犬6只，分为对照组(Ⅰ组)和试验组(Ⅱ组),每组3只，试验组给予高胆固醇饮食，第4周时对犬颈总动脉实行球囊损伤术，记录试验过程中其体质量、血管内径及血脂水平(TC、TG、HDL-C和LDL-C)变化情况，观察颈动脉管腔病理组织切片、脂肪浸润及弹力纤维变化等情况，对照组进行假手术并给予基础饮食。结果表明，试验组体质量随测量时间呈现增长趋势，与对照组差异极显著(P<0.01);球囊损伤术后犬存活率100%,血管内径极显著性降低(P<0.01),且呈中度狭窄；与对照组相比血清水平HDL-C含量变化不显著，TC、TG和LDL-C含量显著升高(P<0.05);20周与第1周(基础值)相比TC含量上升2.0倍，TG含量上升1.6倍，LDL-C上升2.5倍；组织切片可见血管管腔变狭窄，内膜至中膜有脂质沉积，大量泡沫细胞形成，弹力纤维断裂消失。本试验通过饲喂高脂饮食联合球囊损伤可成功使犬颈总动脉形成动脉粥样硬化并导致狭窄，该模型具有成活率高、建模时间短、生理和病理状态相似的特点，可用于研究犬颈动脉粥样硬化导致动脉狭窄的治疗方法。
2023年12期 v.43;No.324 2583-2589页 [查看摘要][在线阅读][下载 1634K] [下载次数：177 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ] - 任晓丽;皇甫和平;米俊宪;宋予震;靳双星;王俊东;石冬梅;
旨在探究槲皮素(quercetin, QU)通过Nrf2信号通路对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的牛乳腺上皮细胞氧化应激的作用及其机制。以牛乳腺上皮细胞系MAC-T细胞为研究对象，用2.5、5.0和10.0μmol/L QU预处理MAC-T细胞12 h后加入1 mg/L LPS处理12 h后；利用试剂盒分别检测LDH活性、活性氧(reactive oxygen species, ROS)、脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性。Western blot和RT-qPCR方法分别检测核转录因子Nrf2相关因子(nuclear factor E2-related factor, Nrf2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)和醌氧化还原酶NADH1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)基因和蛋白表达变化。结果显示，与对照组相比，1 mg/L LPS组中ROS和MDA的含量显著升高(P<0.05),SOD、GSH-Px和CAT活性显著降低(P<0.05),Nrf2、HO-1和NQO1基因和蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05);与LPS组相比，QU预处理能显著降低ROS和MDA的含量(P<0.05),而SOD和GSH-px活性显著升高，且呈剂量依赖性；此外，QU+LPS组能显著上调MAC-T细胞内Nrf2、HO-1和NQO1基因和蛋白相对表达水平(P<0.05)。结果表明，QU通过激活Nrf2信号通路缓解LPS诱导的牛乳腺上皮细胞的氧化应激。
2023年12期 v.43;No.324 2590-2596页 [查看摘要][在线阅读][下载 1641K] [下载次数：602 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：4 ]