- 刘琳;宋亚鹏;刘明洋;高文明;陶明月;宋晓楠;张宜娜;李新生;
为特异性地检测家禽中血清1型禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV)的感染，本研究以血清1型FAdV保守的52K基因为模板设计引物和探针，通过矩阵法优化后建立了针对该病毒的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，并用该方法检测1日龄SPF鸡攻毒后咽、肛拭子排毒量及组织病毒载量。结果显示，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，只能检测出血清1型FAdV,对其他血清型FAdV和其他禽类病毒均无阳性扩增；最低检测限度低至10拷贝/μL;组间和组内离散度均小于2%;标准曲线为y=-3.836x+41.791,相关系数R~2=0.996,具有良好的线性关系；对SPF鸡攻毒结果显示，在攻毒后第1～14日的咽、肛拭子均可检测到血清1型FAdV,在攻毒后第8日的肝脏、肾脏、肌胃、回肠中也可检测到病毒，而腺胃和盲肠中未检出病毒。本研究为血清1型FAdV的定量检测提供了方法。
2024年05期 v.44;No.329 881-886页 [查看摘要][在线阅读][下载 296K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 吕转平;苏晓月;唐思静;王艳萍;张多明;
为建立1种禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)抗体检测方法，试验对AEV VP1蛋白进行截短表达，以表达蛋白为包被抗原建立检测AEV抗体的间接ELISA方法。结果显示，重组VP1蛋白以包涵体形式表达，大小为34 kDa;可与AEV阳性血清发生特异性反应；以VP1蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测ALV、IBDV、IBV、ILTV、NDV、AIV-H9阳性血清均为阴性；检测AEV抗体的最低检出效价为1∶51 200;与IDEXX试剂盒的符合率为95.24%;检测新疆地区1 127份AEV疫苗免疫鸡血清样品和879份未免疫鸡血清样品的免疫抗体阳性率和感染抗体阳性率分别为88.91%和8.19%。结果表明，建立的间接ELISA方法特异、敏感、准确，可用于临床中免疫抗体和野毒感染抗体的检测和筛查。
2024年05期 v.44;No.329 887-892页 [查看摘要][在线阅读][下载 185K] [下载次数：123 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 张雅馨;毛秋艳;刘朔;周婉婷;周淑宁;彭程;李金平;刘华雷;蒋文明;格日勒图;
从NCBI和GISAID数据库中下载H10亚型禽流感病毒的HA基因序列信息，与本实验室保存毒株的序列进行比对、分析、筛选，选择其共同保守区域设计荧光引物和探针，优化反应体系和条件，并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示，该方法具有高度特异性，与其他几种禽源性病毒均无交叉反应；敏感性可达到1.7×10~2拷贝/μL,比普通RT-PCR敏感10倍；批内和批间重复的变异系数(C_v)均小于1.4%,稳定性较好；分别使用鸡胚接种病毒分离法、本研究建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR和普通RT-PCR检测鸡感染试验的拭子和组织样品，结果显示病毒分离法与本研究建立的实时荧光定量PCR方法的总符合率为94.44%,而与普通RT-PCR方法的总符合率为90.74%,实时荧光定量PCR的阳性检出率比RT-PCR更高。结果表明，建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法具有较好的特异性、敏感性和稳定性，有助于H10亚型禽流感病毒的临床检测和监测，对其防控具有一定意义。
2024年05期 v.44;No.329 893-899页 [查看摘要][在线阅读][下载 269K] [下载次数：249 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 柳佳佳;梁海英;曾智勇;汤德元;王彬;叶泥;边孟婷;黄书;田红利;潘向英;
为了解贵州省G9型猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因组特征和遗传进化关系，本试验对送检腹泻仔猪的肠内容物和粪样进行病原检测，选取G9型PoRV阳性样品通过Vero细胞进行分离培养及病毒鉴定，并对分离毒株进行基因组遗传变异分析。结果显示，阳性样品经胰酶预处理后接种至Vero细胞，盲传至第15代出现稳定CPE,前期细胞变圆后固缩、脱落，后期胞浆界限不清，出现拉网现象，用特异性引物对细胞培养物进行RT-PCR鉴定，成功扩增341 bp的目的条带。细胞培养物的间接免疫荧光鉴定显示有特异性绿色荧光反应，电镜观察下可见晶格状排列的无囊膜病毒粒子，大小约70 nm,表明成功分离到1株PoRV,将之命名为GZZY2021。病毒增殖曲线结果显示，用GZZY2021株感染细胞后，0～12 h病毒含量最低，12～30 h病毒增殖速度最快，30～48 h病毒增殖速度较平缓，48 h病毒滴度达到峰值(10~(-5.60)/0.1 mL),而后进入稳定期。全基因组克隆测序分析结果显示，GZZY2021分离株基因组全长为18 506 bp, 11个基因最相似序列同源性均>95.00%,VP1、VP2、VP4、VP7、NSP1、NSP3、NSP4基因与猪源毒株同源性最高，VP3基因与大熊猫源毒株相似性最高，VP6、NSP2、NSP5基因与人源毒株同源性最高，提示分离株为三元重配毒株，完整的基因型为G9-P[23]-I1-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。VP4、VP7基因与同型参考毒株相比，分别发生5、3处独有氨基酸位点变异；与NX疫苗株的中和表位分别存在22、4处氨基酸位点差异。重组分析结果显示，GZAS2020株的NSP5基因是以PTR(FJ422141.1)为主要亲本毒株，A411(EF990694.1)为次要亲本毒株重组产生的毒株，重组断点位于121和321 bp。综上所述，本研究应用Vero细胞成功分离到1株G9P[23]型基因重配PoRV,不但可对持续监测贵州省PoRV的流行动态趋势提供研究数据，而且对筛选该领域的候选疫苗株以及该病的深入研究打下基础。
2024年05期 v.44;No.329 900-906+913页 [查看摘要][在线阅读][下载 488K] [下载次数：404 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 岳慧贤;李其炫;惠丽丽;赵心馨;陈腾;张艳艳;王述超;缪发明;张菲;张守峰;扈荣良;
非洲猪瘟是对全球养猪业危害最严重的病毒性传染病，目前尚无有效疫苗。p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要结构蛋白之一，参与病毒的吸附和侵入，是非洲猪瘟血清学诊断的重要靶标之一。本研究采用无标签的重组p54蛋白作为包被抗原，建立了ASFV p54间接ELISA抗体检测方法，优化了检测条件，组装成了试剂盒。根据对374份阴性猪血清的检测，确定了本试剂盒检测的临界值，并利用不同猪病原阳性质控血清进行了敏感性、特异性和稳定性研究。结果显示，本方法检测阴/阳性血清的临界值为0.250;敏感性血清质控品的最小检出限为1∶1 600倍，与ASFV阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸病毒综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪细小病毒阳性血清和猪抗大肠杆菌阳性血清等6种特异性质控血清均无交叉反应；试制的3批试剂盒批间和批内变异系数均小于10%。试剂盒在2～8℃贮存9个月，特异性、敏感性保持不变。以上试验结果表明，本试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性，与OIE推荐的p72阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较高符合率，为非洲猪瘟临床血清学诊断和抗体监测提供了良好的技术支持。
2024年05期 v.44;No.329 907-913页 [查看摘要][在线阅读][下载 310K] [下载次数：228 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 司露露;高俊龙;张云飞;仇聪蕊;胡慧;李成吾;
猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)是可引起仔猪腹泻、肺炎、繁殖障碍和脑脊髓灰质炎等临床症状的肠道病毒，在腹泻猪和无症状的猪中均可检测到，在我国多地流行，给养猪业造成巨大的经济损失。前期本实验室从仔猪腹泻粪便样品中分离到1株PSV,为探究其对不同日龄猪的致病作用，本研究用相同剂量的PSV分别感染3日龄和2月龄猪。结果表明攻毒后24 h, 3日龄猪出现明显的临床症状(水样腹泻、震颤和食欲不振等),2月龄猪无明显的临床症状。攻毒3 d后，对所有猪进行剖检，qRT-PCR结果表明，3日龄猪和2月龄猪粪便中病毒含量均在攻毒后48 h到达顶峰，且PSV在3日龄和2月龄猪体内均具有广泛的组织嗜性。组织病理学检查结果表明PSV感染3日龄猪只后，可引起明显的肠道病理变化，主要表现为肠绒毛萎缩、脱落等，而2月龄猪肠道无明显的病理变化。综上所述，PSV可感染3日龄和2月龄猪，且可以在体内高效复制，但仅引起3日龄猪发生明显的临床症状，对2月龄猪无明显的致病性。
2024年05期 v.44;No.329 914-920页 [查看摘要][在线阅读][下载 797K] [下载次数：156 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 方剑玉;游一;席燕燕;张青娴;毛展展;徐彬;郎丽敏;陈红英;李绍钰;
为获得高抗病毒活性的猪α亚型干扰素(porcine interferon α,poIFN-α),将天然的poIFN-α17进行突变和合成，并将突变后的猪poIFN-α17基因命名为poIFN-α17m,合成poIFN-α17和poIFN-α17m基因后将其克隆入pVB220大肠杆菌表达载体，将该载体转化DH5α感受态细胞，进行温度诱导表达后，收集菌体进行SDS-PAGE。将表达的蛋白采用Ni琼脂糖凝胶纯化后，采用Western blot检测重组poIFN-α17和poIFN-α17m的反应原性，在PK-15细胞上检测其对VSV和PRV的抗病毒活性，检测重组poIFN-α17和poIFN-α17m蛋白对下游干扰素刺激基因(interferon stimulating genes, ISGs)Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用。结果显示，成功构建了pVB220-IFN-α17和pVB220-IFN-α17m表达载体，实现了poIFN-α17和poIFN-α17m在大肠杆菌中的表达。该蛋白具有良好的反应原性，且重组poIFN-α17m在PK-15细胞上对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)和猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)的抗病毒活性明显高于天然的poIFN-α17,重组poIFN-α17m能有效激活ISGs的表达。
2024年05期 v.44;No.329 921-927页 [查看摘要][在线阅读][下载 342K] [下载次数：113 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 柯文婷;李杨;但汉并;余瑞瑶;汤细彪;董晓辉;
为建立高效检测牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的血清学方法，本研究设计优化LSDV RNA聚合酶30亚基(RPO30)蛋白的密码子，构建其原核表达质粒pET-25b-RPO30,并进行诱导表达和阴离子纯化。纯化后的RPO30蛋白可以被LSDV的阳性血清识别，具有良好的反应原性。用纯化的RPO30蛋白免疫BALB/c小鼠，并将免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，筛选到能够稳定分泌抗体且具有竞争效果的杂交瘤细胞株1H1。以重组RPO30蛋白为包被抗原，经反应条件的优化，建立了基于RPO30蛋白的竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。本研究建立的cELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度为1 mg/L,用含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST作为封闭液37℃孵育2 h,待测血清的最适稀释度为1∶2,1H1抗体稀释度为1∶2 000,兔抗鼠HRP-IgG稀释度为1∶4 000,最佳显色条件是37℃反应15 min。当检测样品的1-S/P≥0.55,判定结果为阳性；当检测样品的1-S/P<0.55,判定结果为阴性。利用该方法检测了LSDV、牛传染性鼻支气管炎病毒(IBRV)、牛支原体(M.bovis)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛布鲁杆菌(B.abortus)、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清，结果显示除了LSDV检测结果阳性外，其他病原的检测结果都是阴性，说明本方法特异性强。利用本试验建立的cELISA检测有免疫背景的临床血清200份，结果显示，其可用于临床疫苗免疫效果的评估。本研究基于重组RPO30蛋白建立的cELISA方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好，为LSDV的检测和预防提供了可靠的技术支持。
2024年05期 v.44;No.329 928-934页 [查看摘要][在线阅读][下载 304K] [下载次数：242 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 孟卫芹;董帅;陈金龙;唐娜;石竞楠;郭璐;宋晶晶;王金良;
为建立一种小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的快速检测方法，本研究将pET-32a-N重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达、纯化获得重组蛋白并免疫BALB/c小鼠，制备了抗PPRV-N蛋白的单克隆抗体并进行HRP标记，通过优化反应条件建立了PPRV阻断ELISA抗体检测方法。经评价该方法与PIV、GTPV、ORFV的阳性血清均无交叉反应；最低能检出1∶160稀释的阳性血清；批内和批间变异系数(C_v)均小于10%;通过对180份临床血清样品进行检测，该方法与竞争ELISA试剂盒的符合率为96%。表明建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性与可重复性，可用于PPRV抗体的检测，为PPRV疫苗的免疫效果评估及疫病防控提供了技术支持。
2024年05期 v.44;No.329 935-939页 [查看摘要][在线阅读][下载 198K] [下载次数：281 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 操义恒;王子杰;贾开文;胡亚辉;王巧梅;党士荣;黄新;周霞;钟发钢;吴桐忠;韩猛立;张星星;张倩;
为了解新疆6月龄内羔羊呼吸道携带的溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)的生物学特性，本研究采集了新疆5个地区8个规模化羊场羔羊鼻拭子290份，采用常规细菌分离鉴定及PCR鉴定方法从鼻拭子中分离鉴定细菌，对分离菌株进行荚膜血清型、MLST分型、毒力基因、药物敏感性及耐药基因检测。结果显示，从290份鼻拭子中分离到14株溶血性曼氏杆菌(Mh42～Mh56),荚膜血清型中9株未定型，3株A2型，A1型和A6型各1株；ST型中5株ST16型、4株ST28型、1株ST46型，4株未定型。感染小鼠在10 h开始死亡，96 h存活率为40%,感染死亡小鼠肺脏充血肿大、部分肺脏出血。14株Mh均携带dnaN、gapA、fbpA、gs60、lktC,sodA,携带率为42.85%,均不携带plpB、tonB、ptfA、fimA。Mh42对多西环素、麦迪霉素、氟苯尼考耐药，Mh54对恩诺沙星、环丙沙星耐药，其余菌株对检测的21类药物还未产生耐药性。14株Mh未检测到耐药基因。本研究为新疆地区羔羊呼吸道溶血性曼氏杆菌的流行病学及临床防制提供参考依据。
2024年05期 v.44;No.329 940-946页 [查看摘要][在线阅读][下载 418K] [下载次数：202 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ]
- 朱盈名;王迎平;冯之航;陈翔;王艳;赵光伟;
为制备抗亨德拉病毒(Hendra virus, HeV)特异性单克隆抗体，本试验用原核表达纯化的HeV-N和HeV-G蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，通过间接ELISA方法筛选抗体阳性杂交瘤细胞，经过筛选和3次亚克隆，获得5株阳性杂交瘤细胞株，其中针对HeV-N蛋白的有3株，命名为2H6、3C2、3G6;针对HeV-G蛋白的有2株，命名为5B8、2A4;利用ELISA方法检测单抗效价2H6与2A4均≥1∶512 000,3G6和5B8效价≥1∶256 000,3C2效价≥1∶128 000;Western blot和间接免疫荧光试验结果显示5株单抗均能与对应抗原发生结合反应；稳定性试验显示细胞传至15代时仍能稳定分泌抗体，稳定性良好；单克隆抗体亚型鉴定结果显示2H6、3C2、3G6均为IgG2b, 5B8和2A4均为IgG1。本试验HeV-N和HeV-G蛋白特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，为HeV新型诊断方法和诊断试剂的开发奠定前期基础。
2024年05期 v.44;No.329 947-952页 [查看摘要][在线阅读][下载 439K] [下载次数：108 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 崔春梅;张爽;张国庆;蒋嵘;高子函;郝鹏飞;李昌;金鑫;李乐天;金宁一;
为获得猪δ冠状病毒(PDCoV)S蛋白受体结合区(RBD)的可溶性蛋白及特异性多克隆抗体血清，本研究将PDCoV流行株S蛋白(GenBank:QAA06990.1)的RBD序列添加信号肽、纯化标签与酶切位点，命名为PDCoV-RBD(简称PDR),对其进行密码子优化后合成并克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体，构建重组质粒pcDNA3.1-PDR。将重组质粒转染至Expi293F细胞进行表达，并利用SDS-PAGE与Western blot进行鉴定；通过Strep-Tactin XT亲和层析纯化目的蛋白，薄层扫描分析蛋白纯度，并以纯化后的PDR蛋白免疫小鼠，制备抗PDR蛋白的特异性多克隆抗体血清，通过间接ELISA测定效价，PDCoV病毒感染细胞后，通过Western blot检测S蛋白与血清的特异性结合效果。结果显示，PDR在Expi293F细胞中获得可溶性表达，纯化得到的目的蛋白大小正确，纯度大于98%;用其免疫小鼠制备的抗血清能特异性结合病毒中天然的S蛋白。本研究获得的PDR蛋白及其小鼠抗血清可为PDCoV的诊断检测与疫苗研制提供必要的物质基础。
2024年05期 v.44;No.329 953-958页 [查看摘要][在线阅读][下载 357K] [下载次数：229 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 肖丽;赵淑庆;袁雪松;范丽原;易鑫;陈琢琦;李彬;李基棕;主性;
为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S和RBD蛋白的293T细胞系，获得PDCoV S和RBD蛋白。本研究将优化合成的PDCoV S蛋白全长基因及其RBD的表达质粒进行双酶切鉴定，将重组质粒pLV-S-Puro、pLV-RBD-Puro、psPRX2、pMD2.G同时转染293T细胞中进行慢病毒包装，收集上清感染293T细胞，经嘌呤霉素初筛得到的多细胞克隆，进一步通过终点稀释法筛选获得稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的单克隆293T细胞系，通过Western blot检测蛋白表达，用纯化的PDCoV S和RBD蛋白分别免疫BALB/c小鼠，对重组蛋白进行免疫原性检测。结果表明，稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的293T细胞系构建成功，获得了重组慢病毒，纯化PDCoV S和RBD重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高的IgG抗体(S:1.2;RBD:0.9),中和抗体水平分别达1∶128和1∶64。本研究构建的293T细胞系能稳定表达PDCoV S和RBD蛋白，为进一步研制PDCoV亚单位疫苗奠定了基础。
2024年05期 v.44;No.329 959-965页 [查看摘要][在线阅读][下载 360K] [下载次数：321 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 孙毅;刘嘉楠;姜合祥;李扬;李娜;李丰阳;雷连成;
猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是诱发细菌性脑膜炎的一种人畜共患病原菌，宿主脑微血管内皮细胞(BMEC)是构成血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的主要细胞，也是病原攻击的重要靶细胞。近年发现宿主细胞核糖体蛋白SA(ribosomal protein SA,RPSA)参与SS2诱发的脑膜炎发病过程，但相关机制仍知之甚少。本研究通过对人脑微血管内皮细胞(human cortical microvessels endothelial cells/D3,HCMEC/D3)RPSA蛋白进行序列分析、相分离能力测定，初步研究了RPSA在SS2感染过程中的作用和机制。结果显示，HCMEC/D3 RPSA具有典型的内部无序区(IDRs)结构域；SS2感染能够诱导RPSA发生相分离，相分离显著增强了细菌对细胞的黏附能力；SS2毒力因子ENO既能够促进RPSA发生相分离，也介导了细菌与细胞的黏附。另外，SS2感染后胞内Ca~(2+)水平升高是促进相分离的关键因素。综上，本研究证实SS2通过提升胞内Ca~(2+)水平，促进RPSA发生相分离，从而增强SS2(ENO)与RPSA的相互作用，导致黏附并进一步引起细胞损伤造成宿主感染。本研究为SS2诱发脑膜炎的认知提供了新思路。
2024年05期 v.44;No.329 966-973页 [查看摘要][在线阅读][下载 801K] [下载次数：123 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 田红利;徐松平;曾智勇;汤德元;梁海英;王彬;叶泥;潘向英;黄书;柳佳佳;边孟婷;
污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica)是一类新出现的罕见人畜共患致病菌，可侵袭动物机体并引起化脓性病症。2018年贵州某猪场送检了2只患病仔猪，呈典型的副猪嗜血杆菌(H.parasuis)混合感染病症。无菌采集病猪肺脏组织，进行细菌培养，通过16S rRNA测序检测到污蝇杆菌。为了解该病原特性，对该菌进行分离纯化培养。从培养特性、革兰染色、生化试验、16S rRNA序列分析、电镜观察等方面对该菌进行系统鉴定；采用药敏试验测定其药物敏感性；通过人工感染小鼠确定其致病性。结果显示，该分离菌株的16S rRNA基因与污蝇杆菌参考株核苷酸相似性介于95.9%～97.6%,与参考株KBL006(NR＿133893.1)遗传距离最近；分离株在血平板、LB固体培养基等的生长良好，在高盐培养基上不生长；生化鉴定结果显示分离菌株的生化特性与污蝇杆菌符合；扫描电镜观察显示该菌菌体长宽为1.30μm×0.53μm;药敏试验结果显示分离株对头孢菌素类、多黏菌素B及部分青霉素、氨基糖苷类药物较为敏感，对四环素类、大环内酯类及喹诺酮类等药物耐药；小鼠致病性试验结果显示分离菌株对小鼠具有致死能力。本试验成功分离到1株猪源污蝇杆菌并对其病原生物学特性进行了初步研究，结果为污蝇杆菌病的病原检测和防控治疗提供了重要参考依据。
2024年05期 v.44;No.329 974-979页 [查看摘要][在线阅读][下载 262K] [下载次数：72 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 姜艳芬;钟建辉;张凯悦;尹婧夷;
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)可引起人类食物中毒和许多非食源性人类胃肠道(GI)疾病。编码其肠毒素(Clostridium perfringens enterotoxin, CPE)的基因cpe若位于染色体的菌易引起食物中毒，cpe位于质粒的菌与非食源性GI疾病相关，因此本研究应用PCR检测、单位点序列分型分析(SLST)、耐热性测定，综合分析cpe~+菌的cpe定位。结果显示，双重PCR检测29株cpe~+菌仅扩增出600 bp的cpe目的条带，未检测出IS1470、IS1470-like、IS1151序列；通过sod、sodFPF PCR检测及SLST分析推测所有检测菌的cpe可能均位于染色体上；7-1和21-3的活菌及芽胞耐热性均高于42-2,推测两者cpe可能位于染色体，而42-2 cpe可能位于质粒上。结果为产气荚膜梭菌引起食物中毒和非食源性疾病的诊断和防控以及cpe的位置与所致疾病相关性的研究提供材料和科学依据。
2024年05期 v.44;No.329 980-986页 [查看摘要][在线阅读][下载 403K] [下载次数：50 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 袁媛;吴克;张雯;崔生玲;杨奇;杨丹娇;奎军;杨文欢;冯航;方明锦;田欣;王兴龙;王娟;杨增岐;
对2020-2022年分离自我国陕西省、甘肃省和宁夏回族自治区的30株D型产气荚膜梭菌进行毒素基因鉴定、耐药性检测、消毒剂敏感性测试和菌株遗传特征分析。毒素基因鉴定显示分离菌株均携带毒素基因cpa和etx,不携带其他分型相关毒素基因。分离菌株对磺胺异噁唑和复方新诺明抗性较强，耐药率分别为30.00%和63.33%;对青霉素、利奈唑胺、克林霉素、多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考敏感，MIC值集中于1 mg/L以下。分离菌株经推荐使用浓度的新洁尔灭、乙醇、84消毒液和浓戊二醛处理10 min后，均可被完全杀灭。经多位点序列分析(MLST),30株D型产气荚膜梭菌中共发现7种不同的管家基因组合；同场区和同省(区)来源的菌株间有相同的管家基因组合和更近的进化关系，并且陕西省和甘肃省的部分菌株间也有相同管家基因组合，揭示了D型产气荚膜梭菌在羊场内部和不同省份之间的传播。综上，本研究在一定程度上在基因水平揭示了D型产气荚膜梭菌的地域性流行和传播，提示在生产中应加强对消毒剂和抗生素的合理使用，以减少D型产气荚膜梭菌的传播。
2024年05期 v.44;No.329 987-993+999页 [查看摘要][在线阅读][下载 298K] [下载次数：160 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ]
- 徐平;阚兴池;黄雅萍;付守鹏;柳巨雄;
乳腺纤维化对奶牛养殖业造成巨大的经济损失，本研究的目的是探究β-谷甾醇(BSS)对TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化是否具有缓解作用。试验分为空白对照组、模型组、模型+药物处理组，以乳腺灌注TGF-β1的方式构建小鼠乳腺纤维化模型，待模型构建完24 h收集小鼠乳腺组织。应用HE染色和Masson染色评价乳腺组织病理结构的变化情况；应用荧光定量PCR方法检测乳腺组织中collagenⅠ、α-SMA、vimentin (VIM)等纤维化相关蛋白的mRNA水平变化；应用Western blot和免疫荧光技术检测collagenⅡ、E-cadherin (E-cad)和α-SMA用于评价乳腺组织中纤维化蛋白表达情况。结果显示，BSS预处理后可以显著缓解TGF-β1诱导的小鼠乳腺病理损伤，显著抑制collagenⅠ、α-SMA、VIM mRNA水平的升高，显著抑制collagenⅡ、α-SMA蛋白水平的升高和E-cad蛋白水平的降低。BSS通过抑制纤维化表型指标的升高有效缓解纤维化病变的发生发展。
2024年05期 v.44;No.329 994-999页 [查看摘要][在线阅读][下载 556K] [下载次数：176 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 张宇飞;周博文;程薪同;付守鹏;柳巨雄;郭文晋;
旨在初步阐明Sirt1在奶牛乳腺氧化应激中对紧密连接的影响及机制。以奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)为研究对象，使用H_2O_2诱导细胞氧化应激构建细胞模型，添加Sirt1激动剂SRT 2104,使用流式细胞术检测细胞中活性氧的含量；通过RT-PCR检测Sirt1基因的转录水平；用Western blot检测Sirt1、ZO-1、Occludin、Cludin 3、p38MAPK、JNK、MLCK、MLC2的蛋白表达水平；通过细胞免疫荧光检测ZO-1、Occludin、Cludin 3的表达；同时使用试剂盒检测细胞的抗氧化能力。结果表明，H_2O_2刺激会显著抑制MAC-T细胞活性并抑制Sirt1基因的表达以及Sirt1、ZO-1、Occludin和Cludin 3的蛋白表达；SRT 2104可以有效改善H_2O_2刺激导致的ZO-1、Occludin和Cludin 3的蛋白表达下降；同时SRT 2104会增强细胞的抗氧化能力并抑制p38MAPK、JNK、MLCK蛋白的表达和MLC2的磷酸化。以上结果表明Sirt1通过抑制p38MAPK/JNK信号传导途径增强细胞的抗氧化能力和紧密连接蛋白表达。
2024年05期 v.44;No.329 1000-1007页 [查看摘要][在线阅读][下载 835K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 王超;姜尚;李心慰;宋玉祥;冯海华;
旨在研究热应激对奶牛中性粒细胞(polymorphonuclear granulocyte, PMN)凋亡的影响，并探究精氨酸(L-arginine,L-Arg)是否对热应激诱导下的奶牛PMN具有保护作用。利用从健康奶牛分离培养的PMN构建体外试验模型，分为对照组(Con组，37℃)和热应激组(HS组，42℃培养0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h),通过CCK-8法检测细胞活性，确定最适热处理时间为2.5 h;将从健康奶牛分离得到的PMN与不同浓度(2、4、6、8、10 mmol/L)L-Arg预孵育30 min后，再置于42℃下培养2.5 h,利用CCK-8法检测细胞活性，最终筛选出L-Arg的最佳使用浓度为4 mmol/L。通过Western blot检测热休克蛋白70(HSP70)和凋亡关键蛋白c-CASP 3的蛋白丰度，流式细胞术检测PMN凋亡率。结果显示，相对于Con组，HS组PMN HSP70蛋白的丰度显著升高(P<0.01),c-CASP 3与CASP 3的蛋白丰度比显著升高(P<0.01),同时PMN凋亡率显著升高(P<0.01);而4 mmol/L的L-Arg预孵育可显著缓解热应激对奶牛PMN的c-CASP 3与CASP 3的蛋白丰度(P<0.01)和凋亡(P<0.05)的影响。这些结果表明，热应激能引起奶牛PMN凋亡，而L-Arg能缓解热应激对奶牛PMN的促凋亡作用。
2024年05期 v.44;No.329 1008-1013+1018页 [查看摘要][在线阅读][下载 366K] [下载次数：238 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 温佳楠;尹钰锋;李铭;王晶晶;季子崴;田艳;王爽;徐闯;杨威;张冰冰;
旨在探讨绿原酸(cholorogenic acid, CGA)是否能通过内质网应激减轻犊牛肝细胞的线粒体自噬。从犊牛中分离出的原代肝细胞经处理后进行培养。首先通过检测犊牛肝细胞中的ROS筛选CGA的最佳质量浓度。用1.2 mmol/L FAs刺激犊牛肝细胞12 h,并用CGA处理12 h。试验设置4个处理组(Ctrl、FAs、CGA、CGA+FAs),分别检测线粒体功能相关指标(CypD)以及线粒体自噬相关蛋白(Parkin、LC3)的表达。结果表明，FAs增加了线粒体功能相关指标(CypD)以及线粒体自噬相关蛋白(Parkin、LC3)的表达，而CGA可减轻这些影响。为进一步研究CGA对线粒体功能的影响，用内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin, TG)处理犊牛肝细胞12 h。结果显示，TG中线粒体功能相关指标(CypD)以及线粒体自噬相关蛋白(Parkin、LC3)的表达均有所增加，而CGA可减轻这些影响，说明CGA可通过内质网应激下调线粒体自噬。总之，本研究结果表明，CGA是一种有效缓解犊牛肝细胞线粒体自噬的治疗工具。
2024年05期 v.44;No.329 1014-1018页 [查看摘要][在线阅读][下载 252K] [下载次数：223 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：5 ] - 陈文东;朱秀娟;叶文斌;王昱;黄新异;邸多隆;徐永平;
为研究橄榄苦苷(oleuropein, OP)对LPS诱导小鼠视网膜损伤的保护作用，将SPFKM小鼠随机分成5组，分别为LPS模型组(LPS)、对照组(Control)、OP高、中、低质量浓度(800、400、200 mg/kg)处理组，连续灌胃21 d,从第14天开始，各组小鼠灌胃30 min后，在异氟烷气体辅助麻醉下，小鼠腹腔注射2.0 mg/kg LPS,对照组小鼠腹腔注射2.0 mg/kg生理盐水，连续7 d,建模完成后，检测小鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性及白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)含量，采用免疫组化SP法检测甘油三脂脂肪酶(PNPLA2)在小鼠视网膜各层结构上的分布特点并观察视网膜组织形态学变化。结果显示，OP使小鼠血清中SOD、CAT和GHS-Px活性显著升高(P<0.01),IL-1β和TNF-α含量下降(P<0.05),视网膜中PNPLA2表达量升高(P<0.05,P<0.01);OP各剂量组均能提高SOD、CAT和GHS-Px活性，降低IL-1β和TNF-α含量，改善LPS对小鼠视网膜的病理损伤，提高视网膜中PNPLA2表达量，具有保护LPS诱导视网膜损伤的作用。
2024年05期 v.44;No.329 1019-1025+1031页 [查看摘要][在线阅读][下载 941K] [下载次数：137 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ]
- 成基;鞠天缘;李童;胡桂秋;柳巨雄;
鸡白痢沙门菌病是危害养鸡行业最严重的疾病之一。抗生素的过度使用导致动物源性细菌产生耐药性。而中药复方替代抗生素已成为相关研究的重点和热点。中药复方“四神丸加减”(Sishen Wan Plus and Minus, SSJ)具有涩肠止泻、益气活血、清热利湿解毒等功能，但是SSJ对鸡白痢沙门菌病的影响尚缺乏研究。本研究旨在研究SSJ对感染白痢沙门菌雏鸡的免疫功能和肠道菌群的影响。将90只1日龄雏鸡均分为6组，空白对照组、鸡白痢沙门菌组、SSJ低剂量治疗组(0.4 g/kg)、SSJ中剂量治疗组(0.8 g/kg)、SSJ高剂量治疗组(1.6 g/kg)、抗生素组。通过16S rRNA测序和ELISA等技术探究SSJ对鸡白痢沙门菌病的影响。研究结果显示，SSJ能够显著降低由白痢沙门菌引起的雏鸡绒毛长度降低以及炎性因子水平的升高(P<0.05)。此外，SSJ也能显著缓解由白痢沙门菌引起的雏鸡免疫球蛋白指数的显著降低(P<0.05)。16S rRNA测序结果显示，高剂量SSJ能够显著增加菌群的多样性以及有益菌的丰度。以上结果证实，添加SSJ能够改善白痢沙门菌感染引起的雏鸡免疫功能减弱和肠道菌群多样性的减少。
2024年05期 v.44;No.329 1026-1031页 [查看摘要][在线阅读][下载 257K] [下载次数：385 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 曹丽光;刘思宇;栾奕;高文睿;刘恺;李国金;杨子凤;董忆飞;李心慰;高文文;刘国文;
围产期奶牛能量负平衡(negative energy balance, NEB)可引起高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids, NEFA)血症。大量NEFA被乳腺组织吸收，可诱发细胞凋亡。白藜芦醇(resveratrol, RES)是一种非黄酮类多酚有机化合物，具有抗炎抗凋亡等作用。目前，尚不清楚RES对高NEFA处理的乳腺上皮细胞(MAC-T)的周期阻滞和凋亡的影响。因此本研究主要探讨NEFA对MAC-T细胞周期阻滞和凋亡的影响以及RES是否能改善高浓度NEFA对MAC-T的病理作用。添加不同浓度的NEFA处理MAC-T,利用CCK-8细胞活力检测试剂盒检测细胞活力，通过Western blot检测细胞凋亡相关分子Caspase-3、Bcl-2、Bax和细胞周期调节因子Cyclin D1的蛋白表达水平，采用qRT-PCR法检测细胞凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA转录水平，利用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果显示，NEFA剂量依赖性地诱导MAC-T细胞凋亡，降低细胞活力，阻滞细胞周期。高NEFA显著增加Bax、Caspase-3的mRNA转录水平和Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白表达，降低细胞周期调节因子Cyclin D1的蛋白表达及Bcl-2 mRNA转录水平。此外，单独添加最高浓度80μmol/L的RES对MAC-T细胞活力无影响，且不会引起细胞凋亡。用高浓度NEFA处理细胞并分别添加10、20、40μmol/L RES,RES的添加可以缓解NEFA导致的Cyclin D1蛋白水平下降，降低Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase-3/caspase-3蛋白水平。同时，RES的添加还可以降低G2/M和S期细胞百分比和细胞凋亡。结果表明，NEFA可以引起细胞周期阻滞和细胞凋亡，RES能缓解NEFA诱导的MAC-T细胞周期阻滞和细胞凋亡。
2024年05期 v.44;No.329 1032-1040页 [查看摘要][在线阅读][下载 774K] [下载次数：273 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 张兰欣;郭文瑞;巩志国;李姣姣;王建宁;刘鑫煜;杨英;李政忆;李娟;高瑞峰;
为探究诃子鞣酸(chebulagic acid, CA)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的小鼠子宫内膜炎的保护作用。本研究体外试验部分，使用MTT法检测CA对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响，通过ELISA和Westen blot分别检测CA对LPS刺激的巨噬细胞促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)分泌水平和ERK、p38和p65磷酸化水平的影响；体内试验部分，通过ELISA分析CA对LPS刺激后小鼠子宫组织TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平的影响，使用组织免疫荧光法检测小鼠子宫损伤相关因子(HMGB1)的表达水平，通过HE染色法观察小鼠子宫组织的病理变化，使用血常规法分析小鼠全血中白细胞数、中性粒细胞数和单核细胞数的变化。结果显示，CA质量浓度为12.5、25.0、50.0 mg/L对巨噬细胞活性均无显著影响，因此后续试验结果与CA的细胞毒性无关。CA可显著下调受到LPS刺激的巨噬细胞中的TNF-α,IL-1β和IL-6分泌水平，且具有浓度依赖性。此外，CA可显著下调受LPS诱导的巨噬细胞中ERK、p38和p65的磷酸化水平。CA可显著下调LPS刺激小鼠后子宫组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平；LPS刺激可增加小鼠全血中的白细胞数、中性粒细胞数和单核细胞数，而使用CA治疗可使其显著降低；相比于LPS刺激组，CA治疗组子宫组织中HMGB1的表达水平显著降低；LPS刺激小鼠子宫后导致子宫角出血和水肿，使用CA治疗后子宫角出血程度和水肿程度均有所降低。同时，HE病理切片显示LPS刺激组小鼠子宫组织中出现大量的嗜中性粒细胞浸润，子宫内膜上皮发生增生、水肿、坏死及脱落，CA(100 mg/kg)治疗后，子宫组织基本恢复正常，具有浓度依赖性。以上结果表明，CA可通过抑制小鼠腹腔巨噬细胞中MAPK和NF-κB通路的激活，下调巨噬细胞和子宫组织中炎症介质的表达水平从而减轻LPS诱导的小鼠子宫内膜炎。
2024年05期 v.44;No.329 1041-1048页 [查看摘要][在线阅读][下载 589K] [下载次数：401 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ] - 侯婕;刘鑫煜;张鹏;赵留威;赵佳乐;马环宇;杨英;高珍珍;
探讨列当水提物(OLE)对谷氨酸(Glu)诱导的氧化衰老的影响及其机制。采用MTT法检测Glu、OLE对细胞增殖活力的影响；根据MTT试验结果确定最佳给药浓度与时间，设置空白组、Glu组(模型组)、OLE低、中、高质量浓度组(1.56、3.13、6.25 g/L)。通过衰老相关β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)检测模型组与OLE组的衰老程度；检测各组超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性及丙二醛(MDA)含量；通过流式细胞仪分析OLE作用12 h后细胞的周期分布；通过Western blot检测Bcl-2、Bax、ERK1/2及磷酸化ERK1/2蛋白的相对表达水平。结果显示：与空白组相比，模型组SOD、GPX活性显著降低(P<0.05),MDA含量显著上升，β-Gal染色阳性率显著上升，而经过OLE预处理再用Glu诱导组的MDA含量出现下降，SOD、GPX活性升高；与模型组相比，OLE预处理能抑制细胞凋亡(P<0.05),作用于PC12细胞的G2期促进细胞增殖；与模型组相比，OLE中剂量组可显著提高ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2的表达，降低Bax蛋白表达(P<0.05)。结果表明OLE可通过提高SOD、GPX活性，抑制MDA的产生，纠正Glu造成的氧化损伤，抑制细胞凋亡；通过提高ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2的表达，降低Bax蛋白表达拮抗Glu带来的氧化损伤，对Glu引起的氧化衰老有预防作用。
2024年05期 v.44;No.329 1049-1056页 [查看摘要][在线阅读][下载 460K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ]