聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒(英文)

为了建立检测猪内源性反转录病毒 (porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法 ,根据已发表的 PERV的序列 ,设计并合成了针对 PERV核心蛋白 (gag)、多聚酶 (pol)、囊膜蛋白 (env)基因的 3对引物 ,预期扩增片段分别为 36 1、15 0、2 6 5 bp。应用 PCR技术检测了 PERV在 4株猪源细胞中的整合情况。结果表明 ,在所有被检细胞的基因组中均存在有 PERV的前病毒序列 ;应用 RT- PCR检测上述 4株猪源细胞中 PERV特异性 m RNA的表达 ,结果均为阳性。试验还对建立的上述 2种方法的特异性进行了探讨 ,结果表明试验建立的 PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究 PERV奠定了基础 ,还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。

犬2型腺病毒毒株纤突蛋白基因的比较分析

根据 Gen Bank中犬腺病毒 (canine adenovirus,CAV)纤突基因序列 ,设计合成 2对引物。用 PCR方法 ,对犬 2型腺病毒沈阳分离株 (CAV- 2 SY株 )第 5代强毒 (SY- V5 )、经蚀斑克隆驯化的第 6 0代毒弱毒 (SY- V6 0 )、SY- V6 0在易感犬体上传 5代的回收毒 (SY- CP5 )、美国疫苗毒 (U S- V2 0 )等 4个毒株的纤突基因进行了扩增 ,PCR产物经纯化后进行基因序列测定 ,测序结果经拼接后得到了 1个由 16 2 9个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列 ,编码 5 43个氨基酸。犬2型腺病毒与 Gen Bank中的标准的 CAV- 2强毒株 (Toronto A2 6 / 6 1)纤突蛋白基因序列的比较结果表明 :CAV- 2 SY株强毒株与 Toronto A2 6 / 6 1株相同 ;SY- V6 0株与 SY- CP5相同 ;与驯化前的 SY- V5相比 ,在 1134位发生碱基颠换 ,编码的氨基酸由原来的天冬酰氨 (N)变为赖氨酸 (K) ,并导致 N- X- S/ T潜在糖基化位点发生改变 ,US- V2 0该部位也发生同样的突变 ,本试验测定和比较的 CAV- 2强毒株有 5个潜在的 N-联糖基化位点 ,弱毒株仅有 4个位点 ;U S- V2 0与 Toronto A2 6 / 6 1差异较大 ,有 11个碱基发生变化 ,导致 8个氨基酸的变异。

犬2型腺病毒E3区缺失性表达载体的构建及外源基因表达

为构建可用于同源重组或体外重组的犬腺病毒 (canim e adenovirus,CAV) E3区缺失性表达载体 ,在克隆的 E3区两末端设计并合成了 2对突变引物 ,在引物中分别引入 1个 Bgl 酶切位点 ,以 p BE3质粒为模板 ,经 2次点突变后 ,得到含有 2个 Bgl 位点的重组质粒 p BE3M。该质粒经 Bgl 酶切后自连得到 E3区缺失的质粒 p BE3Δ。在 p BE3Δ质粒的 Bgl 位点加入接头后 ,产生含多个酶切位点的质粒 p BE3L,经相应的酶切鉴定 ,证明突变、缺失和接头连接正确后 ,利用 p BE3L 分别构建了带有和不带有外源性启动子的绿色荧光蛋白基因的重组表达质粒 ,并分别进行转染以检测其表达。结果显示 ,p BE3L CGFP质粒在转染 DK细胞后 ,于 36 h即可观察到荧光 ,72～ 96 h无明显差别 ,传 3代后仍可见表达荧光的细胞 ;而 p BE3L GFP质粒转染 DK细胞后经检测无表达。结果表明 ,构建的 E3区缺失性载体不能利用 E3区自身的启动子进行目的基因的表达 ,外源性启动子的加入是必要的。

重组杆状病毒表达的2株传染性支气管炎病毒S1蛋白的免疫原性评价

利用 Bac- to- Bac杆状病毒表达系统构建了 2株重组杆状病毒 r Ac JS95 0 3S1和 r Ac SD970 1S1,分别表达了 2株致病性不同的传染性支气管炎病毒的 S1基因。用感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液对 2周龄的伊莎公雏进行免疫 ,根据鸡免疫后的抗体水平动态变化和攻毒后鸡肾脏和气管的保护力判定它们的免疫原性。结果显示 ,重组杆状病毒表达的 IBV S1蛋白可以诱导抗体产生和免疫保护反应 ,2毒株间也存在着一定程度的交叉免疫保护反应。

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)原型株 HPRS- 10 3基因组碱基 #5 394～ #5 416及 #7811～ #7794的 1对引物做 PCR,在 2 0 0 0～ 2 0 0 1年从山东、河南和宁夏分离的 8株 AL V- J中 ,有 6株可以扩增出含 gp85基因的 2 .2 kb左右的特异性片段。对其中 5株的扩增片段做了序列分析 ,结果表明 ,这 5个毒株的囊膜糖蛋白 gp85与原型株 HPRS-10 3有 93.4%～ 96 .8%的同源性 ,与我国最早的分离株 SD990 2有 93.7%～ 98.7%的同源性 ,它们相互之间的同源性为 91.2 %～ 98.7%。由此说明 ,我国 AL V- J的 gp85基因正在不断发生变异。

鸡贫血病病毒VP₂基因在大肠杆菌中的表达及其特性

将鸡贫血病病毒 (chicken anaem ia virus,CAV) VP2 基因克隆入表达性载体 p GEX- 5 X- 3,在大肠杆菌以谷胱甘肽转移酶 (GST)融合蛋白的形式获得了表达。以此表达产物免疫小鼠 ,制备抗 CAV VP2 的多克隆抗体。通过对 CAV感染的 MSB1细胞作间接免疫荧光试验 (IFA)检测 ,结果为阳性 ,这表明表达产物保留了 CAV相关的抗原特性。本研究为进一步探索 CAV VP2 的生物学特性奠定了基础。

黑鲷幼鱼腹水病病原菌

20 0 1年 9月自浙江省宁波市西沪港海区网箱养鱼场养殖黑鲷濒死鱼体内分离到 1株细菌 ,经人工感染试验证明是黑鲷幼鱼腹水病病原菌。其主要特征为 :革兰氏染色阴性 ,短杆状 ,极生单鞭毛 ,氧化酶阳性 ,发酵葡萄糖产酸不产气 ,经 SWF(A )系统鉴定为拟态弧菌。该菌株对磺胺甲基异恶唑、呋喃妥因、复方新诺明、氯霉素、头孢孟多、丙氟哌酸等药物敏感。

鹿源多杀巴氏杆菌荚膜分型及免疫原性

采用 Carter荚膜群鉴定法将分离于我国鹿的 38株多杀巴氏杆菌进行鉴定 ,结果显示 :B型占 6 8.4%(2 6 / 38) ,A型占 18.4%(7/ 38) ,D型占 5 .3%(2 / 38) ,3株未能确定型占 7.9%(3/ 38)。并从 2 6株荚膜 B型巴氏杆菌中选出荧光典型的 8株菌制备免疫原给健康兔注射 ,30 d后用间接血凝法测定各株菌抗体效价 ,选出效价最高的 2株菌 D1 PM和D2 PM用小鼠增毒 ,当毒力稳定后用兔测得 D1 PM ML D为 8个菌 ,D2 PM ML D为 17个菌 ,为疫苗的制造筛选出了优良的菌株。

首次在我国蓝氏贾第虫(Giardia lambia)体内发现病毒粒子

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTR72的表达与鉴定

将重组质粒 p L TR72和 p L T分别转化大肠杆菌 JM10 1、DH5 α 和 C6 0 0 ,并接种于 L B和 CAYE- 2中培养 ,用GM1- EL ISA法检测菌体裂解液中 2者的表达情况 ,将表达产物纯化后用 SDS- PAGE等方法鉴定。结果表明 ,3种大肠杆菌在 2种培养基中都可表达出 L T突变体和 L T,并可将产物分泌到大肠杆菌胞周质中 ,成为具有 GM1结合活性的突变体蛋白 ;鉴定纯化后的突变体的组成形式与野生型 L T相同 ,均是 1A∶ 5 B。

大肠杆菌O157 Z4182基因的克隆与表达

根据大肠杆菌 O15 7Z4182基因设计 1对引物 ,并在其 5′端分别加入 Nco 、Xho 酶切位点 ,用聚合酶链反应(PCR)从本试验用的大肠杆菌 O15 7及 1株产志贺毒素大肠杆菌 (STEC) O8、1株肠道聚集粘附大肠杆菌 (EAgg EC)和 1株产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)菌株中也扩增出了 80 3bp的 DNA片段。以大肠杆菌 O15 7菌株 94H的 DNA为模板 ,用上述引物做 PCR,将其产物连接到载体质粒 p ET2 8a(+) ,然后转化到宿主菌大肠杆菌 L E392 ,从该菌中提取重组质粒 ,再将其转化到表达宿主大肠杆菌 BL2 1(DE3) ,用 PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定 ,表明 Z4182基因定向克隆到了载体质粒 p ET2 8a(+)。将转化子培养并经 IPTG诱导后 ,做SDS- PAGE电泳 ,表明该菌株可以表达 Z4182基因。本试验为阐明大肠杆菌 O15 7Z4182基因的分布及探讨该基因产物的功能和致病作用奠定了基础。

家兔肌肉组织表达外源性生长激素释放因子对增重的影响

用 Wicks法提取 pc DNA- GRF(1～ 32 )质粒并用 DNA Cacu L ator定量 ,同时制备原生质体。将 5 4只家兔随机分为 9组 ,分别注射质粒 pc DNA- GRF(1～ 32 ) 0 .4(用布比卡因处理 )、0 .4(含 10 %甘油 )、0 .4(含 2 5 %蔗糖 )、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8mg及空质粒 0 .1mg和原生质体 1m L( ～ 组 )。分别于注射后 0、3、8、14、19、2 4、31d称重 ;于注射后 0、3、8、19、31d采血并分离血清 ,测定血清中 GH浓度 ,用 t检验进行统计学分析。结果表明 ,布比卡因处理组注射后 3d内GH浓度升高 6 5 %(P<0 .0 1) ,平均日增重 2 9g(P<0 .0 5 ) ;注射 0 .8mg组 31d平均日增重较对照组多 34 .6 2 %;注射原生质体组 31d平均日增重较对照组多 40 .5 7%(P<0 .0 5 )。 31d后将家兔屠宰 ,取注射部位肌肉提取 DNA和总RNA,用 PCR和 RT- PCR方法分别检测到了 GRF在肌肉中的存在和表达 ;用 EL ISA方法没能检测到血清中的 GRF抗体。

生物学成为纳米技术突破口

《科学》评出2002年十大科学成就

寡果糖对肥育猪生长性能、肠道菌群和免疫功能的影响

饲粮中添加 0 .2 5 %、0 .5 %和 0 .75 %寡果糖 ,观察了其对杜长加肥育猪生长性能、肠道菌群和免疫功能的影响。与对照组相比 ,肥育猪日粮中添加 0 .2 5 %、0 .5 %和 0 .75 %寡果糖 ,使日增重分别提高 4.0 0 %(P<0 .0 5 )、9.6 7%(P<0 .0 1)和 10 .6 7%(P<0 .0 1) ,添加 0 .5 %和 0 .75 %寡果糖 ,使料重比分别降低 8.19%(P<0 .0 1)和 7.6 0 %(P<0 .0 5 ) ;添加 0 .5 %和 0 .75 %寡果糖 ,使结肠中双歧杆菌、乳酸杆菌数分别增加 2 99.49%(P<0 .0 1)和 314.81%(P<0 .0 1) ,97.40 %(P<0 .0 5 )和 141.6 7%(P<0 .0 5 ) ,并使结肠内容物 p H值分别降低 0 .5 0 (P<0 .0 5 )和 0 .90 (P<0 .0 1) ;添加0 .2 5 %、 0 .5 %和 0 .75 %寡果糖 ,使结肠中大肠杆菌以及梭菌数分别下降 35 .6 5 %(P<0 .0 1)、86 %(P <0 .0 1)和82 .47%(P<0 .0 1)以及 37.91%(P<0 .0 5 )、98.5 3(P<0 .0 1)和 94.6 6 %(P<0 .0 1) ;添加 0 .2 5 %、0 .5 %和 0 .75 %寡果糖 ,使血清中 Ig A分别提高 11.74%(P<0 .0 5 )、2 4.88%(P<0 .0 1)和 30 .5 2 %(P<0 .0 1) ,添加 0 .5 %和 0 .75 %寡果糖 ,使血清 Ig G分别提高 13.0 5 %(P<0 .0 5 )和 11.42 %(P<0 .0 5 ) ,并使血液中 SOD活性分别提高 2 0 .10 %(P<0 .0 1)和 16 .36 %(P<0 .0 5 ) ,添加

原位杂交技术用于虹彩病毒对美国青蛙侵染的诊断

蛙虹彩病毒 (Rana grylio virus,RGV)能引起鱼类、两栖类和爬行类水生动物严重的系统性疾病 ,RGV是从我国患病蛙中分离到的一种虹彩病毒。体外扩增的 RGV经人工方法感染幼龄美国青蛙 (Rana grylio) ,运用原位杂交技术 ,分别对感染 1～ 3d后的蛙心、肺、肾、肠、脾、肝等 6种组织进行 RGV分子定位和检测。结果显示 ,在幼蛙的肺和肠中有较强的阳性信号 ,在其他组织中也检测到 RGV的存在。本试验探讨了 RGV感染早期在宿主体内的增殖及在不同组织中的分布状况 ,建立了一种蛙虹彩病毒的早期诊断方法 ,并为揭示 RGV的致病机制奠定了基础。

淮南麻黄鸡血清酯酶多态性与屠宰性能及肉质的关系

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 ,测定了淮南麻黄鸡的血清酯酶多态性 ,探讨其与屠宰性能和肉质的关系。结果表明 ,AA基因型鸡的活重、胸肌率和腿肌率均显著高于 AB、BB基因型鸡 (P<0 .0 5 ) ;腹脂率 AB基因型鸡极显著低于 AA、BB型鸡 (P<0 .0 1) ;血清酯酶各基因型鸡的肌肉品质无显著差异 ;AA基因型鸡的腿肌肌纤维直径显著高于 AB、BB型。

饲粮中添加镧对猪生长的影响及安全性

6 0头“杜长大”生长猪分为 2组 (每组 3个重复 ) ,分别饲喂添加 0、10 0 mg/ kg镧 (lanthanum,L a)的相同饲粮 ,进行了为期 30 d的饲养试验 ,以研究稀土元素镧对猪生长性能的影响。采取血样分析了生长激素分泌模式 ,并通过对内脏器官中镧残留量的检测 ,对其饲用安全性进行了初步探讨。结果显示 ,添加镧使生长猪日增重、饲料转化效率分别提高了 13.0 6 %(P<0 .0 5 )和 6 .5 3%(P<0 .0 5 ) ;血清生长激素峰强度、基线水平、总体水平分别提高了 10 3.35 %(P<0 .0 5 )、89.88%(P<0 .0 5 )和 90 .91%(P<0 .0 5 ) ;各器官脏器中镧含量未发现有明显变化。

蓝狐卵母细胞的体内外成熟

对蓝狐卵母细胞成熟时间和超数排卵后卵母细胞的发育阶段进行了研究。采集间情期 (11～ 12月份 )蓝狐卵巢 ,用切割法回收卵泡中的卵母细胞 ,每个卵巢平均获得 8个卵丘卵母细胞复合体 (COCs:cumulus oocyte complexes,480个卵 / 6 0个卵巢 )。COCs在成熟液 (TCMI99+10 %FCS+10 μg/ L EGF+10 IU/ m L PMSG+10 IU/ m L h CG)培养 ,并在不同时间将卵母细胞固定、染色观察其成熟阶段。结果表明 ,核网期卵母细胞在培养前的比例为 80 .70 %(P<0 .0 1) ;GV期卵母细胞在培养 2 4h比例最高 (34 .0 4%,P<0 .0 1) ;GVBD期卵母细胞也是在培养 2 4h比例较高(4 4.6 8%,P<0 .0 5 ) ;M 期卵母细胞在培养 48～ 12 0 h比例较高 (P<0 .0 5 ) ,48h最高 (30 .0 0 %) ;M 期卵细胞在培养 72～ 96 h比例较高 (P<0 .0 5 ) ,72 h比例最高 (2 9.41%) ;卵母细胞在培养 12 0 h退化比例最高 (2 2 .2 2 %,P<0 .0 1)。因此 ,间情期卵母细胞体外培养 72～ 96 h为最佳。对繁殖季节 (3月份 )蓝狐进行超排处理 ,回收卵巢卵泡中卵母细胞及输卵管、子宫角的卵母细胞 ,固定、染色 ,观察其所处的发育阶段。母狐皮下注射 5 0 0 IU PMSG,48h后皮下注射 2 5 0 IU h CG,一组在 72 h后屠宰 ,结果表明 ,母狐卵巢体积虽然有所增大 ,但没有排卵 ,将卵泡中

基因疫苗的免疫方法

我国饲料卫生研究概述