- 李可乐;许景龙;耿笑林;王志飞;梁严予;莫晓琳;黄玉欣;逄文强;田克恭;
为了实现猪圆环病毒3型(PCV3) Cap蛋白在重组大肠杆菌中的高效表达，在10 L发酵罐中考察溶氧(DO)控制策略、氧消耗速率(OUR)控制策略、DO和OUR联合控制策略对目的蛋白表达的影响；通过选择最佳的OUR控制范围确定重组大肠杆菌的高密度发酵工艺；对高密度发酵的蛋白进行SDS-PAGE、Western blot鉴定和免疫评价。结果表明：DO控制策略和OUR控制策略的目的蛋白表达量偏低，检测发现乙酸是影响目的蛋白表达量的主要因素，当乙酸质量浓度达到1.02 g/L时目的蛋白的表达量降低55.8%。DO和OUR联合控制策略在补料前以DO作为控制供氧的参数，在补料后以OUR作为控制供氧的参数，保持OUR值在每小时140～160 mmol/L,可以减少乙酸的生成，目的蛋白的表达量最高为650 mg/L。Western blot鉴定结果显示目的蛋白具有良好的反应原性和特异性。动物试验结果显示二免后抗体阳性率为100%,目的蛋白具有良好的免疫原性。说明DO和OUR联合控制的高密度发酵工艺可以实现PCV3 Cap蛋白在发酵罐上的高效可溶性表达，为进一步进行疫苗研制奠定了基础。
2024年12期 v.44;No.336 2507-2513页 [查看摘要][在线阅读][下载 1877K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 翟文竹;黄颖;陶春豪;何宇恒;储媛媛;王振;庞忠宝;朱鸿飞;贾红;
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的高度接触性传染病。为确定ASFV pp62(CP530R)蛋白的免疫原性，本研究利用真核表达重组质粒pMAL-Fc-CP530R转染HEK 293F细胞表达pp62重组蛋白，通过皮下注射免疫C57BL/6J小鼠，10μg/只，分别于0、21 d等剂量(加强)免疫1次，通过ELISA、IFN-γ ELISpot及流式细胞术等方法评价pp62重组蛋白在C57BL/6J小鼠体内的体液免疫及细胞免疫效果。SDS-PAGE结果显示，HEK 293F细胞表达重组蛋白大小约为118.5 kDa,与pp62蛋白预期大小一致；Western blot结果显示利用ASFV标准阳性血清可检测到特异性条带；ELISA结果表明，pp62重组蛋白一免后7 d即可刺激机体产生特异性抗体，二免后7 d抗体效价可达1∶1 638 400;IFN-γ ELISpot结果显示，pp62重组蛋白免疫C57BL/6J小鼠可产生IFN-γ,与PBS空白组相比差异显著(P<0.05);流式细胞术检测结果显示，免疫小鼠脾淋巴细胞CD4~+/CD8~+ T细胞亚类比值显著高于PBS空白组(P<0.05);Q-Plex~(TM) Mouse多因子检测结果显示，二免后免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10分泌水平显著上调(P<0.001)。结果表明，pp62重组蛋白免疫可以激活机体产生较好的体液免疫与细胞免疫，从而为ASFV pp62蛋白功能研究及ASF新型疫苗抗原筛选提供参考。
2024年12期 v.44;No.336 2514-2520+2555页 [查看摘要][在线阅读][下载 641K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 罗晓莹;林福忠;林秋娟;曾彦钦;陈震;施文豪;
为实现猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)的快速检测，本研究将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick, LFD)技术结合，根据PoRV VP6基因保守序列，设计特异性引物和探针，构建并优化扩增体系，建立了基于RAA-LFD的PoRV一步法快速检测方法，并对检验该方法的特异性、敏感性、重复性及临床应用进行了评价。结果显示，该方法在37℃恒温反应15 min即可实现对PoRV核酸的扩增，最低检出限为22.3拷贝/μL,与其他常见病毒性腹泻病毒均无交叉反应，RT-RAA-LFD与RT-PCR检测方法总符合率为97.0%,Kappa系数为0.93(K>0.75)。本试验建立的RT-RAA-LFD检测方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，并具备快速、可视化和适合现场快检等特点，为PoRV快速诊断和流行病学调查提供了新的技术手段。
2024年12期 v.44;No.336 2534-2539页 [查看摘要][在线阅读][下载 294K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 蒋倩;闵芳;马志刚;梁宇萌;陶芯宇;丁晓军;李添庆;钟旗;姚刚;马雪连;
牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)可引起新生犊牛腹泻和呼吸道疾病，严重时可导致犊牛死亡，给养牛业造成巨大的经济损失。目前我国尚未有自主研发的针对BCoV的疫苗，导致BCoV流行性高、传播范围广，因此开发具有保护性BCoV的疫苗是当务之急。本研究旨在表达BCoV N蛋白并分析其免疫原性，首先用PCR方法扩增N蛋白基因，构建pET-30a-N重组质粒，表达并纯化N蛋白，再将N蛋白与佐剂配伍免疫小鼠；采用间接ELISA检测小鼠IgG和IgA抗体水平及滴度，利用流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞分群比例以及相关免疫细胞因子的释放情况。结果显示，成功获得BCoV可溶性N蛋白，大小约为55 kDa; ELISA检测结果显示，免疫组小鼠血清IgG抗体效价为1∶51 200,免疫组小鼠血清IgA抗体效价为1∶3 200;流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，免疫组CD4~+/CD8~+ T淋巴细胞亚群比例极显著升高(P<0.01),TNF-α释放显著增多(P<0.05),产生偏向辅助性T细胞增加和TNF-α分泌增多的细胞免疫应答。研究表明，通过原核表达系统能成功实现BCoV N蛋白的可溶性表达，且获得的BCoV N蛋白免疫原性良好，可诱导免疫小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应。为开发安全有效的BCoV亚单位疫苗提供了重要的技术支持。
2024年12期 v.44;No.336 2540-2548页 [查看摘要][在线阅读][下载 726K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 张明珠;王鹏;田佳鑫;陈士刚;鲍君铎;仇相书;鲁会军;李昌;
蓝舌病毒(BTV)是我国法定的多种动物共患的二类动物疫病，对反刍动物养殖业的危害极大，BTV共有29个血清型，BTV16是我国目前流行的主要血清型之一。BTV感染后主要表现为隐性感染，因此建立ELISA检测方法对流行病学的检测极为重要。本研究通过原核表达系统进行BTV16 VP2蛋白的表达，使用BALB/c小鼠进行多克隆抗体的制备。建立并优化了以VP2蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法。对广西壮族自治区临床样品进行检测，并与商品化试剂盒进行符合率分析。结果表明，成功表达并纯化出BTV16 VP2蛋白，制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性。ELISA检测方法具有良好的特异性，对赤羽病病毒(AKAV)、口蹄疫病毒(FMDV)和盖塔病毒(GETV)等反刍动物疫病无交叉反应，阴、阳性的临界值为0.314,批间和批内的变异系数(Cv)均小于5%,具有良好的重复性，对79份广西壮族自治区的样品进行检测，阳性率为92.4%,与商品化试剂盒比较符合率为98.7%。本研究成功建立了一种BTV16间接ELISA检测方法，用于牛临床样品的检测。
2024年12期 v.44;No.336 2549-2555页 [查看摘要][在线阅读][下载 383K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 冯旭东;伍琳楠;陈天泽;赵梦茹;刘言言;周学慧;杨晓伟;郁蕾;张立武;赵光伟;
为实现鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)的快速检测，本试验首先对DHAV-3的非结构蛋白3D进行原核表达，纯化后免疫BALB/c小鼠，四免后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合制备单克隆抗体，进而利用单克隆抗体建立双抗夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法，评估其灵敏性、特异性和重复性，最后将所建方法应用于临床样本的检测，并与RT-PCR方法进行符合性验证。结果显示：DHAV-3 3D蛋白在BL21(DE3)中高效表达，经Western blot验证，纯化后的蛋白其特异性良好；细胞融合后经3次亚克隆，成功筛选到6株杂交瘤细胞，分别命名为1A3、1B6、1C7、1D9、2A1和3A9,抗体亚型鉴定结果显示1A3为IgG2b, 1B6为IgG2a, 3A9为IgG3,1C7、1D9和2A1均为IgG1;经筛选，将1B6和1A3两株亲和性高的单抗分别作为捕获抗体与检测抗体，建立DAS-ELISA检测方法，优化反应条件后确定捕获抗体1B6最佳包被质量浓度为1×10~(-3) g/L,检测抗体1A3的最佳稀释度为1∶1 000,阴阳临界值(cut-off)为0.256;灵敏性试验显示该方法对3D蛋白的最低检测限度为4.0×10~(-4) g/L;重复性试验显示，该方法批内、批间变异系数(Cv)均小于9%,重复性好；特异性试验显示，该方法对鸭腺病毒(DAdV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸭疫里默氏杆菌(RA)病原无特异性反应，但与鸭甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)具有交叉反应，可以同时检测出DHAV-3与DHAV-1病原；应用该试验建立的DAS-ELISA方法与RT-PCR检测方法同时对186份临床样本进行检测，DAS-ELISA方法可同时识别DHAV-1和DHAV-3,且与RT-PCR检测方法的符合率为98.9%。结果表明，本试验建立的DAS-ELISA方法重复性好、灵敏性高，可用于DHAV-1与DHAV-3的诊断，为我国鸭甲型肝炎的流行病学调查及防控提供了技术支撑。
2024年12期 v.44;No.336 2556-2563+2578页 [查看摘要][在线阅读][下载 463K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ]
- 雷白时;李秀丽;康佳梦;张会文;李伯森;赵款;张武超;梁飞;袁万哲;
为获得同时具有广谱抗细菌和抗病毒活性的猪β防御素2(PBD2)与猪α干扰素(PoIFN-α)重组融合蛋白，将2种蛋白的基因串联融合后插入pPICZαA载体，电转导入KM71H毕赤酵母细胞构建工程菌，经甲醇诱导表达后，浓缩分离重组蛋白，MTT法和猪红细胞溶血试验测定其细胞毒性，并对重组融合蛋白的体外抗细菌和抗病毒活性进行评价。结果显示，成功获得了pPICZαA-PBD2-IFNα-KM71H毕赤酵母工程菌株，经诱导、表达、浓缩纯化后的融合蛋白PBD2-IFN-α的质量浓度为1.116 g/L,相对分子质量为25 kDa,当蛋白质量浓度低于4~(-4) g/L时对PK-15细胞和猪红细胞无明显毒性，融合蛋白在大肠杆菌或金黄色葡萄球菌混菌平板上产生的抑菌圈直径为(15.0±0.9)mm,均具有比较明显的抑菌活性，Reed-Muench法计算融合蛋白在PK-15中对水泡性口炎病毒(VSV)的抗病毒活性为8.89×10~5 U/mL。为进一步开发该重组融合蛋白作为抗细菌和抗病毒产品奠定了理论基础。
2024年12期 v.44;No.336 2585-2590页 [查看摘要][在线阅读][下载 1355K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王玲;蒋娇;王可甜;罗宗刚;
为探究环状RNA CircFoxO3的表达对猪成肌细胞增殖和凋亡的影响，本试验利用CircFoxO3过表达载体及siRNA转染猪成肌细胞，通过EdU和Annexin V-mCherry检测成肌细胞增殖和凋亡情况，利用RT-qPCR检测凋亡相关基因的表达。结果表明，猪成肌细胞过表达CircFoxO3后增殖细胞数量减少，凋亡细胞数量上升，凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Fas、FasL表达量显著上调(P<0.05),Bax表达量极显著上调(P<0.01),抗凋亡基因Bcl-2表达量显著下调(P<0.05);转染CircFoxO3 siRNA后，成肌细胞凋亡水平下降，增殖能力增加，Bax、FasL基因表达量极显著下调(P<0.01),Caspase-3、Caspase-8表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2表达显著增加(P<0.05)。说明CircFoxO3表达抑制了猪成肌细胞的增殖，促进了凋亡相关基因的表达，从而促进成肌细胞的凋亡。
2024年12期 v.44;No.336 2591-2596页 [查看摘要][在线阅读][下载 399K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 黄瑞雪;马骏;张怀;董肖东;莫罗钰;李键;殷实;
选取猪支持细胞为研究对象，探究3种抗氧化物紫檀芪(pterostilbene, PTE)、槲皮素(quercetin, QR)和姜黄素(curcumin, CUR)对伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)诱导猪支持细胞损伤的保护作用及机制。结果显示，不同浓度FB1(0、20、40、80μmol/L)处理后支持细胞活力显著下降，细胞内的活性氧(ROS)水平显著升高，其中80μmol/L FB1效果最为显著；在80μmol/L FB1处理的支持细胞中添加QR可以显著改善细胞增殖活力，抑制细胞凋亡，在添加3种抗氧化物后增殖凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3以及PCNA的表达也发生显著变化；FB1处理猪的支持细胞后ROS和丙二醛(MDA)的水平显著提高，超氧化物歧化酶(SOD)活力和部分抗氧化酶基因表达水平显著下调，添加3种抗氧化物后支持细胞中ROS和MDA含量均显著降低，其中QR的效果最为显著。同时在3种抗氧化物处理后支持细胞中SOD酶活力显著上调，抗氧化基因SOD1、CAT、GPX1及PRDX1的表达发生显著变化；FB1处理后猪的支持细胞线粒体膜完整性受损，线粒体膜电位下降，添加3种抗氧化物后支持细胞中线粒体膜电位均得到一定程度的恢复。本研究结果为预防和治疗畜禽饲养过程中FB1产生的生殖毒性，进而提高公畜的繁殖性能等提供了理论依据。
2024年12期 v.44;No.336 2597-2604页 [查看摘要][在线阅读][下载 613K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 樊奇;刘昊东;李鹏辉;李嘉成;王星;杜晨光;
胰淀素(amylin)通过影响中枢核团对能量代谢平衡的控制，发挥限制进食量的饱腹作用。然而，amylin在中枢神经系统中的结合位点分布较广，蓝斑核(locus coeruleus, LC)是否响应amylin的刺激作用尚不清楚。因此，本试验欲通过局部LC核团损伤，以此确认amylin是否通过LC发挥抑食作用。结果显示，amylin在抑食的同时，可激活LC内的c-Fos神经元与酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH),并可导致小鼠背肩胛棕色脂肪组织(interscapular brown adipose tissue, IBAT)的产热增加。而LC损伤后amylin介导的中枢采食抑制被缓解，但弱于单纯LC损伤组，同时IBAT的产热能力也降低。本研究结果证明，LC也是外源amylin作用位点之一，并对于amylin导致的产热的维持非常重要。此结果可扩展amylin在中枢的作用范围，并最终为肥胖的治疗提供潜在靶点。
2024年12期 v.44;No.336 2605-2611页 [查看摘要][在线阅读][下载 889K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 吴晓婷;许贤吉;罗宗刚;孙婷婷;王玲;
为探究硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因对牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的调控作用，本试验采用同源重组的方法构建了牛TXNIP基因过表达载体，通过酶切和测序进行鉴定，对得到的序列进行BLAST比对和系统进化分析；将TXNIP过表达质粒转染至牛乳腺上皮细胞，采用CCK-8和EdU检测细胞增殖、Annexin V-mCherry检测细胞凋亡水平，通过RT-qPCR检测细胞中凋亡相关基因mRNA的表达变化。结果表明，牛TXNIP基因CDS区1 176 bp,编码391个氨基酸，与羊的亲缘关系最近。与对照组相比，牛TXNIP基因过表达降低了乳腺上皮细胞活力，使细胞增殖数减少，促进细胞凋亡。过表达TXNIP基因导致牛乳腺上皮细胞中的凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9、Bax表达量显著上调(P<0.05),Caspase-8基因表达量无显著变化(P>0.05),抗凋亡基因Bcl-2表达极显著下调(P<0.01)、Bax/Bcl-2比值极显著升高(P<0.01)。结果表明，TXNIP基因可以抑制牛乳腺上皮细胞增殖，促进细胞凋亡，调控凋亡相关基因的表达，进而影响牛的乳腺发育。
2024年12期 v.44;No.336 2612-2618页 [查看摘要][在线阅读][下载 557K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 杨雅婷;王晓童;刘兆梅;董杨勇;张毓萱;王冉;潘驰宇;邱小燕;肖雄;
为探究熟地黄提取物促进卵巢卵泡发育、缓解卵巢衰老及提高鸡生产性能的作用机制，本研究选用35周龄乌皮红冠产蛋鸡，随机分为空白对照组、0.1%、0.2%和0.4%熟地黄添加组进行饲喂试验；通过检测生殖激素及卵巢上相应受体，量化卵巢与卵泡内的细胞增殖与凋亡损伤，探寻熟地黄提升鸡生殖性能的组织学结构与分子调节的变化；基于PI3K/AKT/mTOR与AMPK信号通路，深入解析熟地黄促进卵巢卵泡发育、缓解卵巢衰老的作用机制，以丰富地方品种鸡的生殖调控理论，提升其生殖性能。结果显示，0.4%熟地黄提取物能够提高蛋鸡血清促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E_2)和孕酮(P_4)的含量，提升卵巢FSHR、ERβ和PCNA基因的mRNA相对表达量，增加PCNA蛋白含量，减少凋亡细胞数量，下调凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3水平；熟地黄可增强鸡去甲肾上腺素的分泌，通过激活卵巢上α_(2A)-AR以及下游PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而有效减缓卵巢功能衰退，保持稳定高效的卵巢机能，且该功效并不依赖于AMPK信号通路。因此，0.4%熟地黄提取物可通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路而增强鸡的生殖功能。
2024年12期 v.44;No.336 2619-2625+2680页 [查看摘要][在线阅读][下载 1897K] [下载次数：0 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]