- 黄颖;翟文竹;陶春豪;何宇恒;王振;储媛媛;庞忠宝;朱鸿飞;贾红;
旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p37重组蛋白对小鼠的免疫原性。使用p37重组蛋白作为抗原,腹部皮下免疫C57BL/6J小鼠。首免后21 d进行二免,ELISA检测血清特异性抗体水平;采用多因子技术检测血清中细胞因子水平;二免7 d分离小鼠脾淋巴细胞,通过ELISpot检测p37重组蛋白刺激后分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数量,并用流式细胞术检测CD4~+T淋巴细胞与CD8~+T淋巴细胞比值。结果显示,间接ELISA结果表明p37蛋白可以刺激小鼠产生高水平的特异性抗体;ELISpot结果显示,p37蛋白可以显著刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ(P<0.001),激活细胞免疫反应;流式细胞术结果表明可以显著刺激T淋巴细胞向CD4~+T淋巴细胞分化(P<0.001);此外血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α免疫相关细胞因子含量在二免以后显著升高。结果表明,ASFV p37重组蛋白免疫小鼠可诱导较强的体液免疫和细胞免疫反应,具有良好的免疫原性,为后续p37蛋白的表位鉴定、功能研究及ASF mRNA疫苗抗原筛选等提供了参考。
2025年05期 v.45;No.341 889-895页 [查看摘要][在线阅读][下载 1476K] [下载次数:37 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:35 ] - 陶春豪;黄颖;王振;姜一曈;朱鸿飞;贾红;
为构建一种环化率高、便捷有效的环状RNA(circRNA)疫苗制备体系,本研究采用基于Ⅰ型内含子的内含子外显子置换(permuted intron exon, PIE)策略,构建了绿色荧光蛋白(EGFP) circRNA,并对体外转录后(IVT)、一次环化后(IVC1)、二次环化后(IVC2)的RNA进行了circRNA环化率的比较,在对circRNA进行纯化后将构建的circRNA体系应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),基于PRRSV GP5蛋白构建了2种circRNA,并进行了体外表达评价。结果显示,IVC1 RNA与IVC2 RNA的EGFP circRNA环化率及蛋白表达效果相近,但均显著优于IVT RNA,纯化后的EGFP circRNA纯度可达74%,使用该制备体系构建的2种PRRSV GP5蛋白circRNA纯度分别为71%与64%,Western blot和间接免疫荧光结果显示2种circRNA均成功表达。结果表明,成功构建了一种操作简便、成本低廉且环化率高的circRNA制备体系,并基于该体系制备了2种PRRSV GP5蛋白circRNA候选疫苗,可实现高效表达,从而为动物circRNA疫苗开发及PRRSV新型候选疫苗的研制提供了理论依据。
2025年05期 v.45;No.341 896-904页 [查看摘要][在线阅读][下载 1777K] [下载次数:48 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:16 ] - 陈千林;李绍梅;张邑帆;牟豪;刘明妮;杨柳;郭庆勇;付利芝;
猪肠道冠状病毒(SeCoV)包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),是引起仔猪严重腹泻的主要病原体,给养猪业造成了巨大的损失。为快速、准确地检测和鉴别这3种病毒,本研究建立了一种三重实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)方法,用于同时检测PEDV、TGEV和PDCoV。根据PEDV M基因、TGEV ORF 1b基因和PDCoV ORF 1b基因的保守序列分别设计了特异性引物和探针。优化反应条件后,成功建立了一种能同时检测PEDV、TGEV和PDCoV的三重RT-qPCR方法。该方法对这3种病毒具有良好的特异性,与猪场常见的猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A群轮状病毒(PoRVA)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等均无交叉反应。对重组质粒pTOPO-PEDV 128、pTOPO-TGEV 116和pTOPO-PDCoV 125线性模板的检测极限分别为16.835、17.610、17.020拷贝/μL。组内、组间变异系数均小于5%,且组间差异不显著(P>0.05)。与标准方法的符合性比较结果显示,三重RT-qPCR的检测符合率为100%,在35份组织样本的检测中,17份呈PEDV阳性,阳性率为48.57%(17/35),TGEV和PDCoV的检测结果均为阴性,未检测到混合感染。结果表明,建立的三重RT-qPCR方法特异、灵敏、稳定、快捷,可同时用于PEDV、TGEV和PDCoV的临床检测和鉴别诊断,为猪腹泻冠状病毒的检测和流行病学调查提供了一种高效、可靠的技术手段。
2025年05期 v.45;No.341 905-912页 [查看摘要][在线阅读][下载 1584K] [下载次数:567 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:17 ] - 胡湘云;陈少梅;宣泽义;罗蒙和;潘锐;杨楷;奚玉莲;曹艳红;
为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突蛋白(S)抗原表位的纳米抗体,并验证其反应活性。本研究采用人工合成PEDV S蛋白抗原表位区域SN,通过原核表达系统构建表达载体pCZN1-SN,对SN片段进行原核表达,经Ni-NTA层析柱进行纯化,利用噬菌体展示技术从天然纳米抗体文库中靶向筛选SN纳米抗体,经过3轮亲和筛选,获得阳性克隆并测序,选取反应活性最强的1株克隆进行原核表达,经Western blot鉴定其反应活性。结果显示,通过原核诱导表达得到SN片段,大小为26 kDa,利用噬菌体展示技术经过3轮淘筛获得特异性纳米抗体,从中选择反应活性最好的1株进行原核表达纯化,获得大小为14 kDa的纳米抗体,Western blot验证该纳米抗体与PEDV SN具有良好结合能力。结果表明,本试验基于噬菌体展示技术,成功筛选并制备了PEDV S蛋白抗原表位片段的纳米抗体,为纳米抗体的深入应用提供了新的途径。
2025年05期 v.45;No.341 913-918页 [查看摘要][在线阅读][下载 1308K] [下载次数:44 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:8 ] - 张大妹;杨柳;高广亮;李绍梅;罗杰;付利芝;余远迪;许国洋;
旨在探究甲苯磺酰基-L-氨基联苯氯甲基酮(TPCK)胰酶对猪流行性腹泻病毒(PEDV)在Vero细胞上增殖规律的影响。试验通过在病毒增殖过程添加TPCK胰酶和常规胰酶,利用RT-qPCR技术,分析病毒吸附和入侵Vero细胞的变化规律,并通过生长曲线绘制、IFA鉴定和细胞活性检测,解析PEDV在Vero细胞上的复制能力变化。结果显示,TPCK胰酶和常规胰酶最适质量浓度分别为1、6 mg/L;PEDV含量随着TPCK胰酶和常规胰酶前处理时间延长呈下降趋势;在病毒增殖过程中添加不同胰酶对PEDV入侵Vero细胞无促进作用,在入侵4 h后,各组病毒粒子均逐渐增加;通过生长曲线绘制,发现TPCK胰酶组在24 h时病毒含量达到最高(lg TCID_(50)=(6.30±0.14)/0.1 mL),且此时产生的荧光强度高于常规胰酶组,36 h时病毒含量呈下降趋势。结果表明,TPCK胰酶对PEDV在Vero细胞上的增殖有更好的促进作用,为TPCK胰酶影响PEDV增殖作用机制进一步研究提供了理论依据,也为PEDV流行毒株的分离纯化提供了数据支撑。
2025年05期 v.45;No.341 919-925页 [查看摘要][在线阅读][下载 1704K] [下载次数:30 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:13 ] - 李振坤;袁晋;路浩;邢金超;李阳;董芳婷;徐盟龙;张越;魏战勇;
为了解2022-2023年河南省猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)的流行变异及其在猪场内部的分布情况,本研究使用荧光定量PCR方法对河南省18个市区规模化猪场的1 206份猪血液样品和2个PCV2阳性猪场共318份猪只及环境样品进行了PCV2检测,并对阳性样品进行ORF2基因测序和遗传进化分析。结果显示,河南省PCV2阳性率为7.05%(85/1 206),其中,豫西地区阳性率最高,达到10.67%(8/75),豫南地区阳性率最低,为1.05%(3/285);并发现春季PCV2的阳性率最高,为11.60%(67/576),夏季阳性率最低,为1.79%(3/168)。测序共得到31条ORF2基因序列,其中23株为PCV2d基因型(74.19%)、6株为PCV2a基因型(19.35%)、PCV2b和PCV2c基因型各有1株(3.23%);氨基酸序列比对结果显示,突变位点主要集中在40~68位与180~209位氨基酸。猪场样品总阳性率为37.42%(119/318),不同类型猪舍的猪只样品阳性率由高到低依次为配怀舍60.71%(34/56)、育肥舍45.83%(11/24)、产房35.09%(20/57)、保育舍33.33(3/9);环境样品的阳性率由高到低依次为饲喂系统56.36%(31/55)、粪便系统46.67%(7/15)、洗消区12.50(1/8)、生活区11.11%(2/18),通风系统未检测出PCV2;人员样品中人员接触的舍内工具阳性率最高为45.00%(9/20),出舍后人员的衣服表面及鞋底阳性率为7.14%(1/14),进舍前人员的衣服表面及鞋底未检测出PCV2。本研究开展了河南省PCV2的流行病学调查及其在猪场内的分布研究,明确了河南省当前PCV2主要的流行毒株、季节、区域以及遗传变异情况;初步分析总结了PCV2在阳性猪场内的分布及潜在传播途径,为PCV的有效预防以及建立精准的生物安全防控措施提供了理论依据。
2025年05期 v.45;No.341 926-933页 [查看摘要][在线阅读][下载 1786K] [下载次数:33 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:7 ] - 李晓君;兰云刚;赵越;李思锐;尚丽元;呼延含蓉;宋斯伟;贺文琦;高飞;王改丽;
由于A型塞内卡病毒(SVA)、水泡性口炎病毒(VSV)新泽西血清型(VSNJV)和印第安纳血清型(VSIV)均可感染猪群,引起口唇及蹄部水疱性损伤,且临床症状相似,易造成误诊。因此,本研究根据SVA-P基因、VSNJV-N基因、VSIV-N基因的保守区分别设计了3对特异性引物,优化了退火温度、引物浓度及反应体系;并利用纳米金材料,建立了一种能同时检测SVA、VSNJV和VSIV的新型、快速、灵敏的多重纳米PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法可特异性扩增SVA、VSNJV和VSIV目的基因,且与猪伪狂犬病毒(PRV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)和猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)均无交叉反应性。敏感性试验结果显示,该检测方法的最低核酸检测限为10拷贝/μL,敏感性较好。此外,最优引物比对不同批次的酶和质粒反应性良好,稳定性强。应用该方法对50份病猪样品进行检测,检出SVA阳性样品7份,普通单一PCR方法检出SVA阳性样品5份;2种检测方法均未检出VSNJV和VSIV阳性。结果表明,本研究建立的多重纳米PCR方法在检测SVA、VSNJV和VSIV方面具有更高的特异性和敏感性,可为猪病毒性水疱性疾病的快速鉴别诊断及防控提供技术支持。
2025年05期 v.45;No.341 934-939+970页 [查看摘要][在线阅读][下载 1339K] [下载次数:14 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:4 ] - 刘硕琦;刘莹;孟子薇;张静雯;范京惠;左玉柱;
为了解河北省部分地区猪源大肠杆菌的致病性、耐药性及其生物学特性,本研究从猪场采集的仔猪腹泻粪便进行大肠杆菌分离鉴定,并对分离菌株进行药敏试验、生物被膜形成能力检测、致病性试验、毒力基因检测、耐药基因检测以及系统进化分群鉴定。结果显示,从腹泻仔猪粪便中共分离到35株致病性大肠杆菌,其中多数为多重耐药菌,至少对3种抗生素耐药。分离菌对阿莫西林(88.57%)、氨苄西林(88.57%)、强力霉素(88.75%)、磺胺异恶唑(77.17%)、林可霉素(100%)和氯霉素(100%)表现出严重耐药;所有分离菌株均携带毒力基因,共检测到5种毒力基因,包括EAST1基因(77.14%)、eaeA基因(17.14%)、stx2e基因(5.71%)、LT基因(2.86%)、STb基因(2.86%);并且分离菌株携带多种耐药基因,共检出bla_(TEM-1)(65.71%)、bla_(CTX-M)(20.00%)、tetA(82.86%)、tetB(14.29%)、aadA2(17.14%)、aac(6′)-Ib(14.29%)、qnrS(17.14%)、sul1(40.00%)、sul2(34.29%)、floR(60.00%)10种耐药基因;系统进化分群分析表明,分离菌株B1群和A群所占比例较高;小鼠致病性试验显示,35株分离菌株感染小鼠后均呈现不同程度的致病性。本研究为河北省猪源致病性大肠杆菌的有效治疗药物选择和防控策略制定提供了科学依据。
2025年05期 v.45;No.341 940-947页 [查看摘要][在线阅读][下载 1385K] [下载次数:140 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:12 ] - 王佳宇;郝小静;孙美玲;刘文华;
为了解大肠杆菌在不同种群鸡的感染状况,本试验对烟台地区3个孵化场的1日龄雏鸡、死胚和9个肉鸡养殖场的临床病死鸡以及淘汰种鸡的1 950份样品进行了大肠杆菌的分离鉴定;通过脉冲场凝胶电泳对分离菌株进行同源性分析;应用PCR进行毒力基因和血清型鉴定;通过接种鸡胚确定致病性;通过药敏试验确定菌株耐药性。结果显示,共分离出116株大肠杆菌,其中成功分型的97株划分为66个带型;经PCR检测出15种毒力基因和5种血清型;鸡胚攻毒试验将其分为高、中、低致病性菌株各56、32、28株;4种不同来源大肠杆菌的耐药性差异显著。结果表明,来自临床病死鸡和淘汰种鸡的大肠杆菌表现出更高的致病性和耐药性。本研究结果对鸡场大肠杆菌病的防控提供了参考依据。
2025年05期 v.45;No.341 948-953页 [查看摘要][在线阅读][下载 1394K] [下载次数:79 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:11 ] - 闫智豪;朱玉红;时间;马兴懌;甘玲;郭建华;
多源曼氏杆菌(Mannheimia varigena,M.varigena)是引起牛呼吸道疾病的重要病原体。转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)是一种直接暴露于细胞外膜的脂蛋白,不仅参与细菌铁离子代谢,还是一种重要的毒力因子。为探究M.varigena的TbpB与牛转铁蛋白(bovine transferrin, bTf)结合关键氨基酸残基突变对其免疫原性的影响,本研究对1株牛源M.varigena进行全基因组测序,预测其铁吸收通路,并通过生物信息学分析预测M.varigena TbpB与bTf结合的关键氨基酸残基,构建了2个M.varigena TbpB突变体:Mv-TbpB~(Y205A)和Mv-TbpB~(Y258A),通过点阵杂交试验和小鼠动物试验分别评估其与bTf的结合活性和免疫原性。结果显示,Mv-TbpB~(Y258A)突变导致其失去与bTf的结合能力,而Mv-TbpB~(Y205A)突变对其与bTf的结合能力几乎没有影响,小鼠免疫试验表明,与野生型TbpB相比,突变体诱导产生了更高水平的特异性抗体;且在攻毒试验中,接种突变型TbpB的小鼠表现出更高的存活率。结果表明,通过定点突变可以增强TbpB的免疫原性,为开发针对M.varigena的新型亚单位疫苗提供了理论依据。
2025年05期 v.45;No.341 954-962页 [查看摘要][在线阅读][下载 1752K] [下载次数:14 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:10 ] - 熊盼;黄艳澜;刘思渝;杨柳;赵光夫;李能章;何芳;彭远义;
A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是引起牛肺炎等呼吸系统疾病的重要病原菌,严重制约我国养牛业的健康发展。目前,主要通过疫苗接种预防该病,但由于Pm血清型众多,导致疫苗交叉免疫保护作用较差。因此,研发具有交叉保护作用的疫苗对防控Pm感染具有重要意义。本课题组前期研究发现,PmCQ2Δcra对A、B、F等不同荚膜血清型菌株(PmA、PmB、PmF)均具有良好的免疫保护作用。转录组学测序分析结果提示,PmCQ2Δcra良好的交叉免疫保护作用可能与细菌表面保护性抗原的高表达有关。因此,本研究通过生物信息分析筛选并表达了4个假定免疫保护性抗原蛋白PmCQ2-5175、PmCQ2-6290、PmCQ2-0275和PmCQ2-2640,结果显示,这些假定抗原制备的亚单位疫苗对PmA感染小鼠的保护效力分别为62.5%、25%、12.5%和10%。其中,保护性最佳的单组分抗原疫苗PmCQ2-5175对PmB感染小鼠具有75%的交叉保护作用。此外,本研究筛选的PmCQ2-5175蛋白保护性优于已报道的Pm抗原蛋白plpE,且融合表达蛋白PmCQ2-5175-plpE对PmA的保护性优于单一蛋白。本研究为开发具有交叉免疫保护作用的Pm亚单位疫苗提供了重要的抗原靶标。
2025年05期 v.45;No.341 963-970页 [查看摘要][在线阅读][下载 1634K] [下载次数:18 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:7 ] - 李富祥;高华峰;赵文华;
旨在对云南省1起山羊呼吸道疾病进行细菌病原鉴定,从患病山羊的肺脏样品中分离到3株革兰阴性小球杆菌(YN240861、YN240862和YN240863),并对其进行了生化鉴定、16S rDNA基因序列相似性与遗传进化分析、致病性试验以及药物敏感性检测。鉴定结果显示,3株分离株的生化特征与睡眠嗜组织菌(Histophilus somni,Hi.somni)模式菌株ATCC 43625~T和其他参考株高度一致;其16S rDNA基因序列与Hi.somni ATCC 43625~T的相似性为99.8%,与其他Hi.somni参考株之间的16S rDNA基因序列相似性为99.4%~99.9%;3株分离株在16S rDNA基因序列遗传进化树中与全部Hi.somni参考株形成同一个进化分支。基于上述鉴定结果,3株分离株被鉴定为Hi.somni。小鼠致病性试验结果显示,3株分离株对小鼠的半数致死量(LD_(50))均≤7.6×10~5 CFU,对小鼠具有较强的致病性。药敏试验结果显示,3株分离株均对青霉素类(氨苄西林)、头孢菌素类(头孢唑林和头孢曲松)、酰胺醇类(氯霉素和氟苯尼考)、氨基糖苷类(卡那霉素和庆大霉素)以及喹诺酮类(氧氟沙星)药物均敏感,但分离株YN240862对磺胺类(磺胺甲恶唑)药物表现出耐药性。本研究在国内首次分离到Hi.somni,证实我国山羊存在Hi.somni感染,为我国山羊Hi.somni感染的防控提供了依据。
2025年05期 v.45;No.341 971-977+986页 [查看摘要][在线阅读][下载 1319K] [下载次数:18 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:7 ] - 刘建勤;张建超;陈智;杨辉;朱红刚;漆亮;陈小军;
为了解湖南省长沙地区养殖场肠球菌的耐药情况,采集猪、牛、鸡和鹌鹑的肛拭子、粪便及环境样本共596份,进行肠球菌分离和质谱鉴定。采用琼脂扩散法测定菌株对10种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),并通过全基因组测序(WGS)分析多位点序列分型(ST)、耐药基因及毒力基因的分布情况。结果显示,共分离出272株肠球菌,分离率为45.6%。分离菌株对头孢西丁和头孢噻呋耐药率最高(68.9%和58.5%),其次是甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(52.2%),而对万古霉素的耐药率最低(4.4%)。值得注意的是,对利奈唑胺的耐药率达13.6%,由于该药物禁用于养殖业,因此,本研究着重对所获得的6株利奈唑胺高度耐药肠球菌进行全基因组测序分析以探索其耐药传播机制。结果显示,ST型最多的为ST403(4/6),均来源于同一猪场,其余的ST型还有ST16(1/6)和ST476(1/6);共检测到21种耐药基因,其中3种恶唑烷酮类耐药基因(cfr、poxtA和optrA)均被发现,其中1株(Ecc60)同时携带这3种基因,但这3种基因均未位于质粒上,此外,tet(M)、aph(3′)-Ⅲ和lsa(A)在6株肠球菌中均被发现。值得注意的是,本研究首次在鹌鹑粪便样本中检测到携带optrA基因的肠球菌。对恶唑烷酮类耐药基因的遗传环境分析发现,来源于同一养殖场的菌株,其cfr(D)、poxtA和optrA的遗传环境有较高相似性。在6株菌中共发现19种毒力基因,其中12种毒力基因(ElrA、SrtA、ace、agg、cCF10、cOB1、cad、camE、ebpA、ebpC、efaAfs、tpx)在6株菌中均有携带,且相同养殖场菌株的毒力基因种类高度相似。结果表明,长沙地区养殖场肠球菌耐药性较为严重,且对禁用于养殖业的利奈唑胺耐药率较高,恶唑烷酮类耐药基因位点附近伴随着其他耐药基因同时出现,尤其是氟苯尼考药物的耐药基因(FexA),可能与养殖场滥用氟苯尼考相关。本研究为肠球菌耐药性监测及防控提供了重要数据支持。
2025年05期 v.45;No.341 978-986页 [查看摘要][在线阅读][下载 1972K] [下载次数:24 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:8 ] - 董志民;王利丽;田向学;路超;张莉;鄢明华;
为快速检测与鉴别鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究根据NCBI数据库中2种病原的16S rRNA基因序列的保守区,分别设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时检测MG和MS的双重TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性和可靠性进行了验证。结果显示,该方法可特异性扩增MG和MS,与21种病原无交叉反应;对MG与MS阳性标准品的检测限分别为5.40×10~1、6.60×10~1拷贝/μL,敏感性较已知方法提高10~100倍;组内和组间的变异系数均小于1%;与NY/T 553-2015中的单一PCR扩增方法相比,阳性样品、阴性样品及总样品检测符合率均为100.00%;利用该方法检测84份疑似支原体感染的鸡病料样品,结果显示,单一感染MG的病鸡样品阳性率32.14%(27/84)、单一感染MS的样品阳性率22.62%(19/84)、混合感染MG和MS的样品阳性率16.67%(14/84);此外,检测182份健康鸡泄殖腔拭子样品、118份健康鸡鼻拭子样品及74份养鸡场环境样品,结果显示,各类样品中均可检测出支原体阳性样本。结果表明,该方法可适用于多种类型临床样品的检测。综上所述,本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可用于MG和MS感染的临床鉴别检测、流行病学调查及病原的净化。
2025年05期 v.45;No.341 987-993+1025页 [查看摘要][在线阅读][下载 1386K] [下载次数:55 ] |[网刊下载次数:0 ] |[引用频次:0 ] |[阅读次数:9 ]